一种生物法合成L‑抗坏血酸棕榈酸酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种生物法合成L‑抗坏血酸棕榈酸酯的方法，该方法利用一类具有多重杂环骨架结构的功能化离子液体共价修饰脂肪酶，再利用该高稳定性、催化活性及反应选择性的修饰脂肪酶在非水介质中催化L‑抗坏血酸与棕榈酸反应制备L‑抗坏血酸棕榈酸酯。提高了产物得率，缩短了反应时间，且操作简单。

【技术实现步骤摘要】
一种生物法合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法
本专利技术涉及一种功能化离子液体修饰脂肪酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，属于食品生物

技术介绍
L-抗坏血酸棕榈酸酯(AscorbylPalmitate，AP)作为一种高效的氧清除剂和增效剂被广泛的应用于乳制品和营养保健食品中，是我国唯一可用于婴幼儿食品的抗氧化剂。与传统婴儿配方奶粉相比，添加AP的新一代婴儿配方奶粉在协调各营养素的均衡，促进婴儿正常发育，延长产品货架期等方面发挥着无可比拟的作用。合成AP的方法主要有化学合成与生物催化法。化学合成法使用浓硫酸、HF等作为溶剂和催化剂，使L-抗坏血酸与棕榈酸(酯)发生酯化(或酯交换)反应。在化学反应中要用到强腐蚀性的浓硫酸和HF，在分离纯化酯时要用到氯仿、甲苯等有毒溶剂，存在着分离纯化复杂、投资成本大、易对人体造成损害、易污染环境等缺点。而生物催化法具有条件温和、能耗低、无有害副产物、分离纯化操作简便等特点。此外生物催化剂—酶可以重复利用，大大降低了成本；并且根据中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布的2016年第九号文件规定“以棕榈酸(或棕榈酸乙酯)和抗坏血酸为原料，经脂肪酶催化反应制得食品添加剂抗坏血酸棕榈酸酯”，作为食品添加剂的AP必须用酶催化法获得。酶促法制备AP，主要利用脂肪酶作为催化剂，使L-抗坏血酸与棕榈酸(酯)发生直接酯化(或酯交换)反应。但从国内外的研究发现，常规脂肪酶在有机溶剂(叔戊醇、叔丁醇等)介质中催化酯化反应仍存在反应活性低、时间过长、产率低、酶用量大、成本高等问题。基于以上研究现状，如何缩短反应时间、提高酶活性及产物得率，同时减少脂肪酶用量已成为制约AP生物法合成的主要问题。离子液体因具备对环境友好的特性而被称为“绿色”溶剂，己经在有机合成与生物化学、电化学、分离过程、催化等领域得到广泛的应用。同时，离子液体又被称为“可设计性”溶剂，通过改变阴、阳离子的结构可调节离子液的物化特性(如极性、疏水性、黏性、熔点、密度等)以完成其在各领域中的应用任务(Task-specificionicliquid)。目前，离子液体在生物催化领域的应用研究往往就是将结构相对简单的传统型离子液用作催化反应介质或少量添加的反应促进剂(enhancer)，以期改善酶促反应，提高产物得率或反应选择性。2011年，BastienDoumèche等研究发现含羟基的离子液体在活化剂作用下可实现甲酸脱氢酶的化学修饰，但这类常规离子液体不仅修饰作用有限，且对酶活影响较大。本专利技术是利用一类功能化离子液体共价修饰脂肪酶，再将此高催化活性及反应选择性的修饰脂肪酶用于催化合成食品添加剂AP，缩短了反应时间，避免环境污染，为生物法制备AP提供了又一成功范例。
技术实现思路
本专利技术提供了一种生物法合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，该方法具有较高的转化率和选择性，同时，缩短了反应时间，避免了环境污染。一种生物法合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，包括以下步骤：在生物催化剂和分子筛存在的条件下，L-抗坏血酸和棕榈酸在反应介质中进行反应，反应结束后，经过后处理得到所述的L-抗坏血酸棕榈酸酯；所述的催化剂为功能化离子液体共价修饰脂肪酶。该方法首先利用一类具有多重杂环骨架结构的功能化离子液体共价修饰脂肪酶，再将此高催化活性及反应选择性的修饰脂肪酶用于催化合成食品添加剂L-抗坏血酸棕榈酸酯。本专利技术具有反应条件温和、反应选择性高、绿色无污染等优点，符合现代食品添加剂制造的要求。本专利技术设计合成了一类具有多重杂环骨架结构的功能化离子液体，该功能化离子液体的阴离子是具有不同亲水性或电负性的极性离子，阳离子是含多重杂环骨架结构的离子，且含有机官能团为羧基。该功能化离子液体可用于对游离脂肪酶进行化学修饰，目的在于提高游离脂肪酶的稳定性、活性及催化选择性。作为优选，所述的功能化离子液体为6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐和5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐；作为进一步的优选，所述的功能化离子液体中阳离子部分的脂肪酸支链选自羧乙基、羧丙基、羧丁基、羧戊基。所述的功能化离子液体的制备方法，包括如下步骤：向6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]咪唑或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]咪唑中加入二氯甲烷，搅拌溶解后滴加卤代脂肪酸酯(摩尔比1:1-3)进行取代反应，20-30℃，反应时间为6-12h，得到取代中间体；得到的取代中间体用盐酸调节pH至1～2，进行水解反应得到水解产物，得到的水解产物经过进一步的离子交换或者直接后处理得到所述的功能化离子液体。本专利技术还提供了一种采用所述的功能化离子液体共价修饰得到的脂肪酶，所述的修饰方法如下：将所述的离子液体、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺按1:1-3:1的摩尔比溶于吗琳乙磺酸(MES)中活化1-3h，将活化后的离子液体与脂肪酶按摩尔比100-1000：1在0-4℃混合反应2-6h；或者将所述的离子液体与CDI按摩尔比1:1-3溶于DMSO中活化1-3h，将活化后的功能化离子液与脂肪酶按摩尔比100-1000：1在0-4℃混合反应1-6h。通过上述方法可以使离子液的活性官能基团与脂肪酶的氨基酸残基通过共价结合得到修饰后的脂肪酶，从而将多重杂环骨架结构引入到脂肪酶的表面。本专利技术中食品添加剂AP的具体制备方法如下：将一定量的L-抗坏血酸、棕榈酸、分子筛、修饰脂肪酶与非水反应介质加入生物反应器中，控制反应温度60℃，反应时间为10h。反应结束后，离心，反应体系经乙酸乙酯洗涤，收集有机相，减压除溶剂，得固体粗产品；过柱纯化，收集有机相，除水，减压除溶剂，得白色固体AP。其中，上述脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、洋葱布克氏菌脂肪酶；或上述一种或多种的脂肪酶。其中，上述脂肪酶的用量为底物用量的1-5g/L。其中，上述非水反应介质为离子液体或有机溶剂；或离子液体与有机溶剂的混合物。其中，上述的反应介质为离子液体，三辛烷基甲基季铵盐、氯化-1-烯丙基-3-甲基咪唑盐、1-乙基-3-甲基咪唑乙酸正离子、1-丁基-3-甲基咪唑鎓氯化物、1-羟乙基-3-甲基咪唑四氯硼酸盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑十二烷基磺酸盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑氯盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑硫酸氢盐、1-羟乙基-3-甲基咪唑硝酸盐；或上述一种或多种的混合离子液体。其中，上述反应介质为有机介质，叔丁醇、叔戊醇、正己烷、环己烷、异辛烷、丙酮、辛醇、丁醇、十二烷醇、2-甲基-2-丙醇、DMSO；或上述两种或多种有机溶剂的混合物。作为最优选，所述的反应介质为异辛烷和tOMA·TFA的混合物，此时，催化效率最高。其中，其中，上述L-抗坏血酸的用量为12-20g/L,且与棕榈酸的摩尔比为1:1-1:8。其中，上述反应温度为50-65℃。其中，上述催化反应时间为6-48h。其中，上述分子筛为3A或4A型。同现有技术相比，本专利技术的有益效果体现在：本专利技术提供的功能化离子液体修饰脂肪酶催化合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，具有多重杂环骨架结构的功能性离子液体对脂肪酶实施了有效化学修饰，调整酶活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生物法合成L‑抗坏血酸棕榈酸酯的方法，包括以下步骤：在生物催化剂和分子筛存在的条件下，L‑抗坏血酸和棕榈酸在反应介质中进行反应，反应结束后，经过后处理得到所述的L‑抗坏血酸棕榈酸酯；其特征在于，所述的催化剂为功能化离子液体共价修饰的脂肪酶。

【技术特征摘要】
1.一种生物法合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，包括以下步骤：在生物催化剂和分子筛存在的条件下，L-抗坏血酸和棕榈酸在反应介质中进行反应，反应结束后，经过后处理得到所述的L-抗坏血酸棕榈酸酯；其特征在于，所述的催化剂为功能化离子液体共价修饰的脂肪酶。2.根据权利要求1所述的生物法合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，其特征在于，所述的功能化离子液体为6,7-二氢-5H-吡咯[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐和/或5,6,7,8-四氢吡啶[1,2-α]-3-脂肪酸咪唑六氟磷酸盐。3.根据权利要求2所述的生物法合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，其特征在于，所述的功能化离子液体中阳离子部分的脂肪酸支链选自羧乙基、羧丙基、羧丁基或羧戊基。4.根据权利要求1所述的生物法合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，其特征在于，所述的脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶、褶皱假丝酵母脂肪酶、南极假丝酵母脂肪酶、猪胰脂肪酶、根霉脂肪酶、洋葱假单胞菌脂肪酶、洋葱布克氏菌脂肪酶中的至少一种。5.根据权利要求1所述的生物法合成L-抗坏血酸棕榈酸酯的方法，其特征在于，所述的脂肪酶的用量为底物总量和的1.2～2.5％(质量百分比)。6.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：石玉刚，张峰，房升，石平华，张润润，万一栋，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33