螺旋藻多糖及其提取方法和在制备升白和抗癌药物中的用途技术

本发明专利技术涉及螺旋藻多糖，提取方法和在制备升白和抗肿瘤药物中的用途。其中制备方法包括以下步骤：Ａ、多糖提取；Ｂ、提取液调蛋白等电点，然后离心；Ｃ、离心液取上清液浓缩至一定浓度，采用乙醇沉淀，离心或过滤去除不溶物；Ｄ、上清液进行二次乙醇沉淀，再干燥，得螺旋藻多糖提取物。本发明专利技术的多糖提取物多糖含量在６０％以上，对肿瘤放化疗的骨髓造血功能损伤和抑制具有明显的防治作用，尤其升白作用优于升白安。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及螺旋藻多糖，其提取方法以及在制备升白和抗癌药物中的用途。近几十年来，国内外对中药材钝顶螺旋藻进行了一系列的药理和临床研究，结果表明钝顶螺旋藻具有升高白细胞、补血、提高机体免疫功能、调节血脂、抗癌、抗辐射损伤等多种药理作用。白细胞减少症临床颇为常见，它的发病原因很多，特别是在肿瘤病人的治疗中，因术后体虚和放、化疗对骨髓造血功能的毒性更为棘手，而当前中药制剂的升白作用有待进一步提高，西药又有一定的副反应。虽然文献报道了螺旋藻的升白作用，但并未单独对螺旋藻多糖进行这方面的研究。本专利技术人经研究发现，螺旋藻多糖具有显著的升白细胞作用，其疗效优于升白安，尤其可用于放化疗后的白细胞减少。而且，还具有显著的抑制肿瘤的作用。本专利技术的螺旋藻多糖提取物主要是在已知螺旋藻具有的药理及临床作用有效的基础上，采用现代生物技术的理论和方法，从确有实效的单味螺旋藻提取有效部位而制成的具有较高水平的升白和抗肿瘤药物。用本专利技术方法制备的多糖提取物，多糖含量大于60％。质量收率介于4.2～4.6％之间。制备本专利技术的多糖提取物包括以下步骤A、多糖提取，采取稀碱温浸提取法、水溶液温浸提取法或盐溶液温浸提取法，优选水溶液温浸提取法；B、提取液调蛋白等电点，然后离心；C、离心液取上清液浓缩至一定浓度，采用乙醇沉淀，离心或过滤去除不溶物；D、上清液进行二次乙醇沉淀，再干燥，得螺旋藻多糖提取物。关于多糖提取方法，可参阅张惟杰主编复合多糖生化研究技术，上海科学技术出版社，1987年。吴梧桐主编生物制药工艺学，中国医药科技出版社，1993年，385页。其中提取一般用4-10倍，优选约7-8倍量的提取液，在70-90℃，优选约85℃的温度下进行约7-10小时。可以提取1-3次。蛋白等电点一般调至4-约6.5，优选5.0左右。离心速度通常在3000-7500转/分之间，优选约3600转/分。多糖的醇沉浓度在约50％～80％之间，优选75％。浓缩的倍数在2-6倍之间，优选4倍。多糖提取物优选于60-70℃，优选60℃，真空下(约0.090Mpa)干燥5-9h，优选8h来进行干燥，如此可使多糖的含水量低于9％。但也可按普通方法进行干燥，但温度不能太高。本专利技术利用多糖溶于水的特点用热水浸提，不仅可使多糖释放、溶解，而且可缩短提取时间，防止腐败并使蛋白变性。根据蛋白在其等电点时溶解度最小的原理，提取液调pH5.0，沉淀提取液中大量杂蛋白，然后用离心的方法去除蛋白沉淀。利用多糖难溶于高浓度乙醇的特点，用乙醇沉淀多糖；采用75％乙醇沉淀多糖同时还可以除去大量无机盐、单糖、氨基酸和小分子量的多肽。TLC及GC分析表明此多糖提取物中多糖主要由鼠李糖、岩藻糖、葡萄糖三种单糖组成。其摩尔比为(3.9∶1.4∶11.3)。分子量为3,390～2,907,623，该多糖主链以葡萄糖为主，各单糖存在多种联结方式。通过颜色反应及红外光谱分析证明，该多糖链上有糖醛酸基团及硫酸基团。含量测定参照中国药典95版附录IV分光光度法中比色法测定。按照药监局新药审批办法要求研究了螺旋藻多糖提取物的初步稳定性。在室温下，对三个批号970710、970815、970912进行了0月、1月、2月、3月考察，考察项目为性状、鉴别、水分、灰分、pH值、霉菌细菌总数及含量测定。各项指标均符合要求。结论螺旋藻多糖提取物在常温下稳定。按《中药药效学研究指南》的要求进行螺旋藻多糖提取物主要药效学试验。试验结果表明(1)螺旋藻多糖提取物15～60mg/kg/d，给药12天呈剂量依赖性，使CTX所致小鼠骨髓DNA含量，有核细胞数和外周血白细胞数减少得以回升。作用优于阳性药升白安片的作用。(2)螺旋藻多糖提取物12mg/kg/d预先给药5天，并于照射第7天(骨髓抑制最明显期)，总给药26天，对60Co-γ射线导致的犬骨髓粒细胞系统有核细胞比率和外周血细胞数减少有明显防治作用。(3)螺旋藻多糖提取物对药物性(CTX)和放射性60Co-γ射线骨髓造血功能损伤和抑制具有明显的防治作用。并进行毒性试验，结果如下(1)小鼠急性毒性试验螺旋藻多糖提取物水溶液以最高浓度、最大容积(大于5000mg/kg)给小鼠一次灌服和腹腔注射后，连续观察7天，未见动物发生异常表现和死亡，其最大耐受量定为5000mg/kg。(2)大鼠长期毒性试验螺旋藻多糖提取物分别按240mg/kg、40mg/kg灌服，连续给药90天及180天，给药后，所有动物的一般状况，血液常规、生化指标，主要脏器系数及组织形态学均未出现明显异常变化。(3)犬的长期毒性试验螺旋藻多糖提取物分别按20mg/kg和200mg/kg喂饲犬，连续给药6个月后，所有动物的一般状况、心电图、血液学及血液生化指标、病理组织学检查均未出现明显异常变化。在500L搪玻璃罐内加40kg 100目干燥藻粉和320L水，搅匀，夹套加热至内温85℃，保温提取8小时，提取过程中每0.5小时搅拌10分钟以保持提取液均匀和各处温度恒定。温浸结束后冷却到室温，以4mol/L HCl和4mol/L NaOH调节pH5.0，静置1h待大量蛋白沉淀，SS-600离心机离心分离，离心残渣采用初提条件再提取1次，离心弃去二次残渣。清液合并后在500L薄膜浓缩设备中于70℃、0.085MPa真空度下减压浓缩至原体积的四分之一，共得140L浓缩液(折算为d20从1.12g/ml升至1.28g/ml)。待溶液冷却至室温后，加392L 95％药用乙醇使醇浓度为75％，静置8小时以上，离心过滤，并以40L 95％药用乙醇分两次淋洗滤饼后滤干。沉淀(3.5kg)用15倍(52.5L)水溶解并过滤，滤液加入95％乙醇至乙醇浓度为75％沉淀多糖，静置、过滤，用少量95％药用乙醇洗涤沉淀。所得湿固体于60℃、0.090MPa真空度下干燥8h。质量收率介于4.2～4.6％，即每1000g藻粉原料可得42～46g螺旋藻多糖提取物。以硫酸-苯酚法测定糖含量大于60％。试验一、多糖的质量考察1、多糖的定性分析(1)称取螺旋藻多糖提取物1g加50ml水，制成水溶液。取5ml于试管中加10％α-萘酚乙醇试液2-3滴，摇匀后沿管壁加浓硫酸0.5ml，于两液界面间呈棕色环。(2)另取上述糖溶液1ml于试管中加1ml 6％苯酚试液和5ml浓硫酸，摇匀，溶液呈棕黄色。2、多糖含量测定取中试产品6个批号，分别精密称定100mg，置己放有滤纸的小漏斗中，用95％热乙醇(70℃)20ml洗涤，将残留物及滤纸挥去乙醇后一并放入100ml锥形瓶中，加水40ml在电炉上加热至微沸，搅拌溶解，再沿瓶壁加水30ml，冲下粘附其上的多糖，继续加热至微沸保持数分钟，趁热过滤至100ml量瓶中，用70℃水20ml分三次洗涤锥形瓶及滤纸，放冷后用水定容至刻度，从中吸取2.0ml加水稀释至50ml，作为供试品溶液。另精密称定101.2mg无水葡萄糖对照品溶于100ml量瓶中，加水至刻度，吸5.0ml再至100ml容量瓶中，定容至刻度。制备成每100ml含5.06mg葡萄糖的溶液作为对照品溶液。精密吸取供试品溶液2.0ml；对照品溶液0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml，对照品溶液不足2.0ml的加水至2.0ml；空白对照取水2.0ml代替葡萄糖溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
螺旋藻多糖提取物，特征在于采用以下步骤制备： Ａ、多糖提取； Ｂ、提取液调蛋白等电点，然后离心； Ｃ、离心液取上清液浓缩至一定浓度，采用乙醇沉淀，离心或过滤去除不溶物； Ｄ、上清液进行二次乙醇沉淀，再干燥，得螺旋藻多糖提取物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：尹鸿萍，王旻，孙进，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]