抗肿瘤和免疫调节白术多糖、生产方法和用途技术

本发明专利技术涉及一种从中药材白术中提取的多糖、其生产方法和用途。本发明专利技术采用常压煎煮获得白术水提液，有机溶剂沉淀、沉淀用水溶解，上清液经透析或膜分离和浓缩干燥获得总多糖，白术总多糖经有机溶剂分级沉淀和柱层析获得白术多糖ＡＭＰ－１，其化学结构以β－（１→２）－连接－Ｄ－半乳糖为主链，有的半乳糖在０－６位有β－Ｄ－甘露糖末端分枝，该多糖无毒副作用，具有抗肿瘤和调节免疫功能作用。本发明专利技术方法工艺简单、产率高，适宜工业化生产。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及从生药白术中提取白术多糖AMP-1的化学结构和生产方法。本专利技术是从生药白术中提取获得的多糖，其化学结构为β-(1→2)-连接-D-半乳糖为主链，且有1/3～1/2的半乳糖的C6上有β-D-甘露糖末端分枝。本专利技术的制备方法是将生药白术用水浸泡，采用煎煮获得水提液，有机溶剂沉淀，透析或膜分离，浓缩干燥获得白术总多糖。白术总多糖用有机溶剂二～三次分级沉淀获得白术多糖精品，再经凝胶柱层析纯化得多糖纯品AMP-1。该多糖无毒副作用，具有抗肿瘤和调节免疫功能作用。该多糖由完全酸水解、还原、乙酰化和GC分析得知由甘露糖和半乳糖组成，其甘露糖和半乳糖摩尔比为1∶2.0～3.0，推荐的摩尔比为1∶2.5。例如实测甘露糖和半乳糖摩尔比为1∶1.91，经四舍五入为1∶1.91。由ESI-MS和HPLC分析得知分子量在3200～5800左右，推荐的平均分子量在3800左右。其谱图数据例如下面所述IR 936cm-1(β-D-吡喃半乳糖基)；1H-NMRδ(ppm)＜5.0(β-D-吡喃半乳糖基和β-D-吡喃甘露糖基)；13C-NMRδ1(ppm)106.4(C-1)，84.4(C-4)，80.7(C-2)，78.0(C-3)，65.4(C-5)，64.3(C-6)；δ2(ppm)95.7(C-1)，76.0(C-4)，75.7(C-5)，74.5(C-3)，72.8(C-2)，63.7(C-6).δ1为β-D-比喃半乳糖残基，δ2为β-D-吡吡喃甘露糖末端残基。从AMP-1甲基化、还原、乙酰化衍生物的GC-MS图谱分析得知，AMP-1含有1→碎片、→21→和→2，61→碎片，其摩尔比2∶2～4∶2。根据甲基化、NMR等分析，AMP-1具有以下重复单元结构 式中，Manp为甘露糖，Galp为半乳糖，1、2、6分别代表单糖的取代位置，n＝0～2，m＝3～4。本专利技术的制备方法包括将生药白术干燥用水浸泡，煎煮获得水煎液提取白术多糖(其目的是获得与临床用药水煎剂加工方法相同的白术多糖)。采用不同浓度的有机溶剂沉淀2～3次获得白术多糖精品，精品再经凝胶柱层析纯化可得多糖纯品AMP-1。具体来说，将干燥后的生药白术粉碎或切片，用水浸泡，煎煮，其中生药白术与浸泡水或煎煮水的重量比推荐是白术∶水＝1∶5-15，尤其推荐用10-12倍重量或更多的水，浸泡0.5-12小时。常压煎煮时间推荐0.5-2小时。所述水推荐为无离子水。浸泡液和水提液的pH值推荐保持在5.0-8.0。过滤，滤液经或不经浓缩，用有机溶剂沉淀后离心。离心所得沉淀用水溶解，推荐用1-5倍重量的水溶解。离心，上清液透析或膜分离，透析时间推荐为24-72小时，透析用透析膜、透析袋，其孔径推荐截留分子量在1000以下，尤其推荐截留分子量为500～1000的。浓缩干燥获得总多糖，其中干燥或减压浓缩温度推荐低于60℃进行，最好采用低温真空浓缩或冷冻干燥，例如在30～60℃干燥或浓缩，压强推荐控制在0.08～0.1MPa。所得白术总多糖加水溶解，其中推荐加1-5倍重量的水溶解。然后加有机溶剂沉淀。离心，上清液重复加有机溶剂沉淀。上述沉淀推荐加2～6倍体积的与水互溶的有机溶剂，尤其推荐加2倍体积的与水互溶的有机溶剂沉淀24小时。离心，沉淀用水溶解，透析或膜分离后冷冻干燥获得白术多糖精品，纯度可达90％以上。多糖精品再经凝胶柱层析作进一步纯化，用水或稀盐溶液洗脱，收集糖峰，膜分离后冷冻干燥获得白术多糖纯品AMP-1，纯度可达99％。凝胶柱层析所采用的凝胶为Sephadex G型、Sephacryl S型、Superose、Bio-Gel P型或Superdex，选用的分离范围为5×102～1×104道尔顿。推荐凝胶用Sephadex G-25，用0.1MNaCl洗脱。前述的用有机溶剂沉淀，所述有机溶剂推荐与水互溶的有机溶剂，可以是低碳链的醇或酮，例如C1～C6的醇或酮等；尤其推荐乙醇，例如用2～6倍体积的75％～95％的乙醇；沉淀时间推荐为12-72小时。本专利技术的白术多糖AMP-1易溶于水，具有抗肿瘤和调节免疫功能的作用，其可用于制备抗肿瘤和调节免疫的药品或保健品等。用本专利技术方法获得的白术多糖AMP-1对小鼠S-180肉瘤和小鼠Lewis肺癌均有明显的抑制作用，均可以提高荷瘤小鼠的NK细胞的活性，具有明显的增强免疫功能作用。本专利技术首次从白术中提取白术多糖AMP-1。本专利技术的提取分离方法简便，产率高和适于工业化生产。该多糖适用于口服和注射液用药。具有显著抑制肿瘤生长和显著增强免疫功能的作用。图3是白术多糖AMP-1红外光谱图谱。仪器Bio-rad FTS-185。其中936cm-1处有吸收峰表明有β型半乳糖残基。图4是白术多糖AMP-1的GC-MS图谱中的GC图谱。其表明有3个碎片峰，具体碎片质量见图5，6，7。图5是白术多糖AMP-1的MS图谱，其对应于GC图中的18.357min峰，表明有→21→。图6是白术多糖AMP-1的MS图谱，其对应于GC图中的18.585min峰，表明有→2，61→。图7是白术多糖AMP-1的MS图谱，其对应于GC图中的15.686min峰，表明有1→。图8是白术多糖经两次有机溶剂沉淀得到的白术多糖精品的HPLC图，图中 图9是白术多糖AMP-1纯品的HPLC图，图中 具体实施方式实施例1将生药白术1公斤洗净干燥，粉碎，用10升无离子水室温浸泡1小时，常压煎煮1小时并不停搅拌，过滤。残渣用5升无离子水继续煎煮1小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至2-4升。然后用95％的乙醇沉淀，乙醇终浓度为80％，醇沉24小时。离心，沉淀用2.5升水溶解，离心，无离子水透析48-72小时。60℃减压浓缩后冷冻干燥，即获得白术多糖100克。加水2升溶解，离心，上清液加4升95％乙醇醇沉24小时，离心。上清液再加入4升95％乙醇醇沉24小时，离心，沉淀用1升水溶解，然后减压浓缩、冷冻干燥，获得平均分子量3800±380左右的白术多糖10克。实施例2将生药白术1公斤洗净干燥，粉碎，用10升无离子水室温浸泡2小时，常压煎煮1小时并不停搅拌，过滤。残渣用5升无离子水继续煎煮1小时，过滤，合并滤液，60℃减压浓缩至4升。然后用6倍体积的95％的乙醇沉淀，乙醇终浓度为82％，醇沉72小时。离心，沉淀用4升水溶解，离心，无离子水透析72小时。55℃减压浓缩后冷冻干燥，即获得白术多糖120克。加水2升溶解，离心，上清液加4升95％乙醇醇沉24小时，离心。上清液再加入4升95％乙醇醇沉24小时，离心，沉淀用1升水溶解，然后减压浓缩、冷冻干燥，获得平均分子量3800左右的白术多糖11.8克。实施例3白术总多糖经不同浓度乙醇分级沉淀获得分子量3800左右的精制多糖，纯度为90～95％，该多糖再经Sephadex-G-25柱层析，即获得纯度为99％的纯多糖。具体分离方法称取精制多糖150mg，溶于3～5ml蒸馏中，离心(4500r/min，10min)。取上清液上玻璃柱(1.5cm*100cm)，用0.1M NaCl洗脱，流速为0.5ml/min，每管收集3～5ml，大约10～20管为吸收峰。收集，，蒸馏水透析24小时，冷冻干燥，即获得纯多糖110m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗肿瘤和免疫调节水溶性白术多糖，其特征是具有如下重复单元结构： ＊＊＊ 其中ｎ＝０～２，ｍ＝３～４，Ｍａｎｐ为甘露糖，Ｇａｌｐ为半乳糖，１、２、６分别代表单糖的取代位置。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：田庚元，单俊杰，
申请(专利权)人：中国科学院上海有机化学研究所，浙江京新药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]