一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的提取及制备方法。本发明专利技术取天然药物白芨块茎进行多糖组份初步提取，经小分子脂溶性物质去除蛋白，再经离子交换层析、凝胶过滤层析，得纯品提取物白芨多糖材料，呈固体粉末状，再灭菌处理等。本发明专利技术从天然药物白芨中分离、提取得到的白芨多糖作为一种多糖，能与细胞外基质成分作用，促进细胞黏附与贴壁生长；同时，白芨多糖作为天然药物成分，其交联所得的膜，成型良好，具有很强的韧性，良好的生物相容性和可降解性，是组织工程材料的良好选择。解决了现有技术无法克服的多糖物质具有较强的亲水性及较难的可塑性的缺陷。本发明专利技术制备方法简单，易于控制，费用低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物制品，特别涉及一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的提取及制备方法。
技术介绍
近二十年来，人们一直研究应用于组织工程的生物材料。通常是将体外培养的高浓度的种子细胞种植于天然或人工合成的细胞外基质载体上，并复合诱导因子，然后移植于体内，达到形成新的有功能的组织的目的。常用的组织工程材料按照来源可分为人工合成材料和天然材料两大类。人工合成材料包括目前已被广泛应用的羟基磷灰石(HA)，生物活性玻璃陶瓷(BGC)，聚乳酸(PLA)，聚羟基乙酸(PGA)等，它们也常被复合运用而发挥更佳的效果。人工材料的优点是结构牢固，有适宜的生物力学强度，优良的骨传导性和较好的生物相容性。然而，与天然生物材料相比较，人工材料存在着成本较高，表面活性较差，不利于细胞黏附、分布与增殖，并有诱发免疫反应可能的缺陷。顾名思义，天然材料即是指天然存在的，从人体或动植物中获取的材料，如胶原(collagen)、松质骨等，这类材料抗原性弱，组织亲和性和结合力良好，其天然的孔隙结构为细胞的黏附、生长提供了最佳的三维空间。不过，当前得到应用的天然材料也有其缺点，如胶原获取困难，机械强度范围较窄，诱导细胞分化能力单一而且不足等等。因此，寻找一款既廉价易得，还具有促进细胞黏附与生长能力，同时又来自于天然产物的材料，是当前组织工程学的热点方向。细胞外基质(extracellular matrix，ECM)由多种复杂的成份构成，包括各型胶原、可溶性细胞因子、化学介质、蛋白多糖、糖蛋白、肽类、脂肪酸和各种小分子物质等。ECM可影响细胞的分化、增殖、黏附、形态发生和表型表达等生物学过程。作为生物界重要组成成份的各种多糖(polysaccharides)，既是细胞外基质的成分之一，也被认为可以与细胞外基质发生密切作用，如促进胶原蛋白分泌，诱导细胞因子表达等等。正基于此，国内外大量实验已经证明，来自于动植物的各种多糖物质，的确具有促进多种细胞分化与增殖的作用。此外，不同分子量大小和残基修饰的多糖，还具有调节免疫，降低血脂，抗癌，抗病毒等多方面功效。然而，尽管多糖物质拥有极佳的生物相容性和综合多样的生物效应，但由于其存在着较强的亲水性及较难的可塑性的缺点，至今没有被广泛地运用于组织工程和其他的生物材料领域。
技术实现思路
本专利技术的目的就在于克服上述现有技术存在的缺陷，研制一种从天然药物白芨中提取多糖材料及制备方法。本专利技术的技术方案是一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料，其主要技术特征在于从天然药物白芨块茎中提取得到多糖材料。本专利技术的另一技术方案是一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料的制备方法，其主要技术特征在于步骤如下(1)取天然药物白芨块茎进行多糖组份初步提取，再经小分子脂溶性物质去除蛋白，再经离子交换层析、凝胶过滤层析，得纯品提取物白芨多糖材料，呈固体粉末状；(2)将白芨多糖提取物经下述方法处理(2-1)将固体粉末状多糖材料灭菌处理；或(2-2)将固体粉末状多糖材料溶解于溶剂，形成一定黏度的溶液，灭菌处理；或(2-3)将固体粉末状多糖材料溶解于溶剂，形成一定黏度的溶液，在细胞培养皿表面铺成均匀薄层，风干后经化学处理后交联，得不溶于水的膜状材料，灭菌处理。本专利技术的优点和效果在于从天然药物白芨中分离、提取得到的白芨多糖作为一种多糖，能与细胞外基质成分作用，促进细胞黏附与贴壁生长；同时，白芨多糖作为天然药物成分，其交联所得的膜，成型良好，具有很强的韧性，良好的生物相容性和可降解性，是组织工程材料的良好选择。本专利技术所采取的浓度范围在在每10毫升水，磷酸缓冲液，无机盐溶液或其他有机溶液中，含天然药物白芨的多糖提取物100-300毫克。本专利技术采用了多种贴壁生长的细胞，实验证明(1)对于鼠肺成纤维L929细胞，人肝L-02细胞，鼠单核巨噬细胞Raw264.7，人胚胎肾细胞293T，人脐静脉血管内皮细胞HUVEC，人骨髓基质干细胞hMSC等数种细胞，白芨多糖材料可以明显促进它们的黏附与生长速度；(2)对于人肝癌HepG2细胞，白芨多糖材料可以促进它的黏附速度，但不能诱导其增殖；(3)对于非洲绿猴肾COS-7细胞与人宫颈癌细胞HeLa，白芨多糖材料不具有促进它黏附生长的作用。本专利技术通过对天然药物白芨块茎提取多糖成分，经处理得到了白芨多糖材料。它具有促进多种细胞黏附生长的作用，并具有极好的生物相容性和可降解性，是一款具有良好应用前景的生物材料。附图说明图1——为白芨多糖半纯品经凝胶过滤层析得单一洗脱糖峰。图2——为白芨多糖纯品红外光谱图。图3——为白芨多糖交联成膜后，试铺L929成纤维细胞，于0.5小时拍摄照片图。图4——为白芨多糖膜上L929成纤维细胞黏附生长趋势图。图5——为白芨多糖膜上非洲绿猴肾COS-7细胞黏附生长趋势图。图6——为白芨多糖膜上人肝L-02细胞黏附生长趋势图。图7——为白芨多糖膜上人肝癌HepG2细胞黏附生长趋势图。图8——为白芨多糖膜上鼠单核巨噬细胞Raw264.7黏附生长趋势图。图9——为白芨多糖水溶液作用下人宫颈癌细胞HeLa黏附生长趋势图。图10——为白芨多糖水溶液作用下人胚胎肾细胞293T黏附生长趋势图。图11——为对照组人脐静脉血管内皮细胞HUVEC黏附生长形态照片图。图12——为白芨多糖水溶液作用下人脐静脉血管内皮细胞HUVEC黏附生长形态照片图。图13——为白芨多糖水溶液作用下人脐静脉血管内皮细胞HUVEC黏附生长趋势图。图14——为白芨多糖膜上人骨髓基质干细胞hMSC黏附生长趋势图。具体实施例方式第一步白芨多糖纯品的提取及溶液配制取市售中药兰科植物白芨块茎，充分碾碎后水煮3小时，沸腾8-10次，三层纱布过滤取滤液，加入两倍体积无水乙醇，沉淀过夜；离心弃去上清，反复三次后取沉淀抽滤，溶于双蒸水，Sevag法沉淀蛋白杂质，反复多次至考马斯亮蓝法检测无蛋白；无水乙醚萃取，取水相冻干得白芨多糖粗品；粗品经DE-52离子交换柱(Whatman产品)层析，蒽酮—硫酸法检测得单一洗脱峰，冻干得白芨多糖半纯品；半纯品经Sephadex G-200凝胶过滤柱(Pharmacia产品)层析，蒽酮—硫酸法检测得单一洗脱峰，见图1。冻干得白芨多糖纯品，红外光谱检测多糖组成为葡萄糖与甘露糖，见图2。将20毫克多糖纯品的固体粉末溶解于1毫升双蒸水，形成具有黏度的溶液，滤膜过滤除菌备用。第二步白芨多糖膜的制备(一)按照第一步所述方法配制白芨多糖纯品溶液，并按每孔250微升滴加于24孔细胞培养皿并敞放于超净工作台中，待其完全风干后取出。接着进行60Co-γ射线照射20分钟，即得不溶于水的膜状材料，灭菌后备用。膜形态观察肉眼观察质地均一，透光性佳，基本呈透明状；光学显微镜观察表面有微粒状纹路；水溶性观察在三块膜上分别滴加500微升蒸馏水，0.5摩尔/升醋酸溶液，RPMI-1640细胞培养液，放置72小时，未见膜形态变化；试铺L929成纤维细胞(培养方法和接种方法见后面第四步)观察，细胞分散良好，见图3。或者采用第三步白芨多糖膜的制备(二)按照第一步所述方法配制白芨多糖纯品溶液，并按每孔250微升滴加于24孔细胞培养皿并敞放于超净工作台中，待其完全风干后取出。接着进行强紫外光照射60分钟，即得不溶于水的膜状材料，灭菌后备用。按照第二步所述方法进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于促进细胞黏附生长的多糖材料，其特征在于从天然药物白芨块茎中提取得到多糖材料。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙剑涛，张峻峰，王春明，刁华佳，
申请(专利权)人：南京大学医学院附属鼓楼医院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]