细菌多糖与免疫原蛋白共价结合物的制备方法技术

共价修饰的细菌多聚糖和蛋白质；这种共价结合物是通过可以证明其共价性并有利于结合物纯化的双属间隔基把多聚糖和免疫原细菌膜蛋白或其它蛋白联结起来的；这种结合物是细菌疫苗的有用成分，及制备这种多聚糖，蛋白质和结合物的方法，证明多聚糖与蛋白质间共价键的方法．（*该技术在2005年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术的内容是关于共价修饰的细菌多糖和免疫原性蛋白质，由一个双属间隔基连接的这种多糖的共价结合物，它有利证明其共价性和生物学上所希望的具有免疫原性的细菌膜或其它蛋白质实体的纯化和浓缩，这些结合物是细菌疫苗的有用成分。本专利技术亦与这些多糖、蛋白质和结合物的制备方法以及证实多糖和蛋白质之间结合物连接的共价性的方法有关。纯化的细菌荚膜多糖已被用于制备抗同族细菌的疫苗，但免疫应答的结果常常不像所希望的那样满意，特别是幼儿和免疫系统不成熟或不健全者。如流感嗜血杆菌B型荚膜多糖不能引起婴儿的免疫应答。因此制备这种多糖本身不能保护小儿抵抗由该杆菌所致的严重小儿医疗问题。将其与蛋白质结合常可增纯这些多糖的免疫原性。如可参看Schneerson et al.，“Haemophilus Influenjae Type b Polsaccharide-Profein C onjugatesModel for a New Generation of Capsular Polysac charid Uaccines，”New Dev.with Hum.d Vet.Vaccines，77-94(1980);Schneerson，et al.，J.Exptl.Med.，152，361(1980).，和Anderson，Infection and Immu nity，39，233(1983)。但必须细心选择与这些多糖结合的蛋白质，某些蛋白质(Pertussinogen)是婴儿免疫系统的非特异性刺激剂。在一定程度上这些蛋白质增强对多糖抗原的免疫应答。但不幸的是这种非特异性激活作用导致一些所不希望的生物学效应(即反应原性)。通过将这些多糖结合到适当蛋白质上如首先由W.F.Goebl和O.T.Avery在1929年所报告的那样能使婴儿增强对这些抗原的很多好的特异性免疫应答(J.Exptl.Medicine 50，521-531(1929))。多糖与蛋白质结合的方法亦必须细心考虑，假如如所相信的那样，免疫增强是多糖决定簇向蛋白质载体决定簇分子接近的结果，那么这些部位在生物系统中是不易分离开的。由多糖的多阴离子特性和载体蛋白质的阳离子特性所产生的非共价复合物可以刺激免疫应答，但这些复合物是化学上不稳定的，其免疫应答看来是非T细胞依赖的。相反，多糖和蛋白质的共价结合物具有强得多的化学稳定性而且能证明是T细胞依赖的免疫应答。多糖-蛋白质共价结合物文献中已有所述，但共价连接的精确性质尚未被证明或被定量，因为对于共价性的唯一分析方法是在体内的活性，而文献中所描述的程序难以重复出来。流感嗜血杆菌b型，肺炎链球菌6A型多糖先与溴化氰反应，后与脂肪酸二酰肼反应，最后与破伤风类毒素或鲎蟹血蓝蛋白质结合(Schneerson al.J.Exptl.Med.，152，361(1980)和Infe ction and Immunity，40，245(1983)。肺炎球菌19F型多糖通过从多糖还原端和蛋白质侧胺基(即赖氨酸)形成亚胺(Schiff碱基)而直接结合到牛血清蛋白上，然后用氰硼氢化钠还原这些亚胺(Lin et al.，Immunolo gy，46，333(1982))。另外，连接到重氮化芳香胺上的多糖结合到蛋白质的酪氨酸上(K.K.Nixdorff et al.，Immunology 29，87(1975))，连接到芳香胺的多糖转换到异硫氰酸盐上，然后连接到蛋白质的赖氨酸侧氨基上(S.B.Svenson and A.A，Lindherg，j.Immunolog.Methods 25，323(1979))。但上述任何一种方法所产生的结合物都仅仅是凭其凝胶渗透层析特性鉴定的。在另一个例子中(S.Nutani et al.，Infection and Immunity 36，971(1982))，多糖，出芽短梗孢糖(Pullulan)用氰尿酰氯(Cyanuric chloride)活化，然后与破伤风类毒素反应。此法所生成的结合物以电泳法而且仅仅表明是不同于开始的物质而鉴定的。除了用推断聚合分子量以外，这些方法中没有一个能证明其共价性，因此将与分子复合物中多阴离子和多阳离子的相互作用的共价性相混淆，因为这些复合物亦将给出一聚合分子量。因而本专利技术的一个目的是将多糖决定簇连接到蛋白质载体决定簇上，这样以使得这些部分的分子接近度在生物系统内能够维持。本专利技术的另一个目的是将荚膜多糖与载体蛋白质共价连接和建立起一个能证明和定量测定这种连接的共价性质的方法。本专利技术还有一个目的是获得一些化学上稳定的多糖-蛋白质结合物，它们证明是T细胞依赖的，而且作为菌苗成分是有用的，因为它们能引起对某些细菌，特别是与所用多糖同族的细菌的保护性血清抗体的产生。本专利技术的一个进一步的目的是建立起一个方法用于制备多糖-蛋白质结合物过程溶解多糖，特别是多阴离子多糖和共价地修饰在制剂中的这些多糖。本专利技术再有一个目的是建立起一个方法用来纯化和浓缩共价连接的多糖-蛋白质结合物以除去未结合的大分子和过剩的反应剂。本专利技术还有一目的是建立起一些方法以在免疫学上有效的菌苗中应用这些结合物来治疗脑膜炎和中耳炎。本专利技术旨在共价地修饰细菌多糖和这些多糖与共价修饰的免疫原性膜蛋白质、病毒蛋白亚单位、合成多肽、细菌类毒素或其它合适的免疫原性蛋白质形成化学上稳定的结合物，这些结合物是免疫原性细菌菌苗的有用成分。本专利技术的多糖-蛋白质结合物是通过含有一个共价硫醚基的双属间隔基相结合而成的，其中双属间隔基是连接大分子(如多糖和蛋白质)的原子链，间隔基的一部分来源于一个修饰的大分子(如共价修饰的多糖)，另一部分来源于另一个修饰的大分子(如功能化了的蛋白质)。根据本专利技术的程序，以一个或多个步骤共价地功能化多糖使其具有一些侧基亲电子中心或侧巯基。最好是先将多糖溶于一非羟基有机溶剂中，然后在与双亲核试剂反应前与一双功能的激活剂起反应。亲核试剂功能化的多糖或与一能产生侧基亲电子位置的试剂反应或与一能产生侧巯基的试剂反应。通过适当选择双亲核试剂，即它能与活化了的多糖反应成为具有侧基亲电子部位或巯基的共价修饰的多糖，或者选择一适当的亲核试剂，而这种亲核试剂功能化了的多糖无需进一步功能化。与多糖的共价修饰无关，适当的细菌“载体”蛋白质与能产生侧巯基的试剂或与能产生侧亲电子中心的试剂反应，在任何一种情况下，一或两个步骤即可。适当共价修饰的多糖和蛋白质起反应并形成共价的多糖-蛋白质结合物，除去非结合的大分子和过剩的试剂使其纯化并根据共价连接的多糖测定免疫原性的剂量。通过从多糖的侧链亲电子或巯基部位裂解(如通过水解)和通过从蛋白质的侧链巯基或亲电子部位来裂解蛋白质，然后分析含硫醚的双属间隔基分子，通过分析蛋白质中决定共价性的标记氨基酸(赖氨酸)来测定此间隔基的浓度，由此可以完全证明和阐述此种连接的共价性本质。然后就可制备出一些含有免疫学上有效量的多糖-蛋白质结合的免疫原疫苗或它们的衍本文档来自技高网...

【技术保护点】
把有酸性基团的细菌荚膜多聚糖的免疫原蛋白通过含如下式的硫醚键双属间隔基结合制备多聚糖－蛋白质结合物的方法，Ａ－Ｅ－Ｓ－Ｂ其中Ｅ是＊＊＊或＊＊＊，Ｒ是Ｈ或－ＣＨ↓〔３〕；Ａ是＊＊＊；这ｍ是０到４；ｎ是０到３；Ｗ是０或ＮＨ；Ｙ是ＣＨ↓〔２〕，Ｏ，Ｓ，ＮＲ′或ＣＨＣＯ↓〔２〕Ｈ；这里Ｒ′是Ｈ或Ｃ↓〔１〕－或Ｃ↓〔２〕－的烷基；如果Ｙ是ＣＨ↓〔２〕，那么ｍ和ｎ二者不能都为Ｏ或Ｓ，ｎ也是大于１；而Ｂ是＊＊＊这里ｐ是１到３，ｑ是０到２，Ｚ是ＮＨ↓〔２〕，＊＊＊，Ｒ′如上定义：该方法包 括下列步骤：（１）有酸性基团的细菌荚膜多聚糖通过下列步骤加溶：（ｉ）用大的疏水阳离子取代多聚糖的酸性基中的氢，生成多聚糖的盐，然后（ｉｉ）把多聚糖的盐溶在不含水，极性的质子惰性溶剂；（２）用一种双功能试剂活化多聚糖；（３ ）把这种活化的多聚糖与一个双一亲核试剂反应；（４）把这已与一种双－亲核试剂反应了的活化的多聚糖与一种产生亲电子部位的试剂反应，从而与侧面亲电子部位生成一种多聚糖。（５）使免疫蛋白单独地与一种产生硫醇基的试剂反应，与侧面硫醇基生成一种 蛋白；然后（６）通过超速离心法把含有侧硫醇基的蛋白中分子量低的硫醇除去；然后（７）使具侧面亲电子部位的多聚糖与具侧面硫醇基的蛋白质反应，生成一种多聚糖－蛋白质结合体，它是通过共价的硫醚键使二者连接的，然后（８）把混合液离心，以除 去非共价联结的多聚糖和蛋白质。...

【技术特征摘要】
1.把有酸性基团的细菌荚膜多聚糖和免疫原蛋白通过含如下式的硫醚键双属间隔基结合制备多聚糖-蛋白质结合物的方法，A-E-S-B其中E是，R是H或-CH3；A是Y(CH2)nNH-；这m是0到4；n是0到3；W是0或NH；Y是CH2，O，S，NR′或CHCO2H；这里R′是H或C1-或C2-的烷基；如果Y是CH2，那么m和n二者不能都为O或S，n也是大该方法包括下列步骤(1)有酸性基团的细菌荚膜多聚糖通过下列步骤加溶(i)用大的疏水阳离子取代多聚糖的酸性基中的氢，生成多聚糖的盐；然后(ii)把多聚糖的盐溶在不含水，极性的质子惰性溶剂；(2)用一种双功能试剂活化多聚糖；(3)把这种活化的多聚糖与一个双一亲核试剂反应；(4)把这已与一种双-亲核试剂反应了的活化的多聚糖与一种产生亲电子部位的试剂反应，从而与侧面亲电子部位生成一种多聚糖。(5)使免疫蛋白单独地与一种产生硫醇基的试剂反应，与侧面硫醇基生成一种蛋白；然后(6)通过超速离心法把含有侧硫醇基的蛋白中分子量低的硫醇除去；然后(7)使具侧面亲电子部位的多聚糖与具侧面硫醇基的蛋白质反应，生成一种多聚糖-蛋白质结合体，它是通过共价的硫醚键使二者连接的，然后(8)把混合液离心，以除去非共价联结的多聚糖和蛋白质。2.根据权利要求1所述方法，其中所用具酸性基团的细菌荚膜多聚糖是从流感嗜血杆菌(Haemophilus influonzae)b型多聚糖和肺炎球菌(Streptococcus pnenmoniae)6B型，19F型和23F型多聚糖中选择的。3.根据权利要求1所述方法，其中所用免疫原蛋白是脑膜炎双球菌B血清型外膜蛋白或麻仁球蛋白。4.根据权利要求1所述方法，其中所用含酸性基团的细菌荚膜多聚糖是流感嗜血杆菌b型多聚糖，免疫原蛋白是脑膜炎双球菌B血清型外膜蛋白，它们是通过下式双属间隔基联结的5.根据权利要求1所述的方法，其中所用含酸性基团的细菌荚膜多聚糖是肺炎球菌6B型多聚糖，免疫原蛋白是一种脑膜炎双球菌B血清型外膜蛋白，它们是通过下式双属间隔基联结的6.根据权利要求1所述的方法，其中所用含酸性基团的细菌荚膜多聚糖是肺炎球菌19型多聚糖，免疫原蛋白是一种脑炎双球菌B血清型外膜蛋白，它们是通过下列双属间隔基联结的7.根据权利要求1所述方法，其中所用含酸性基团的细菌荚膜多聚糖是肺炎球菌23F型多聚糖，免疫原蛋白是一种脑膜炎双球菌B血清型外膜蛋白。它们是通过下式双层间隔基联结的8.一种加溶含有酸性基团的多阴离子多聚糖的方法，它包括(1)用大的疏水阳离子代替多聚糖中酸性基团的氢，以使多聚糖呈盐的形式，然后(2)把以盐形式的多聚糖溶在不含水的极性的质子惰性溶剂。9.一种根据权利要求8所述的方法，其中大的疏水阳离子是从含有三或四(C-C)烷基-铵，1-氮杂双环(2.2.2)辛烷和1，8-二氮杂双环(5.4.0)十一烷-7-烯的一组物质中选择的。10.一种根据权利要求9所述的方法，其中的不含水的极性的质子惰性溶剂是从含有二甲基甲酰胺，二甲基亚砜，二甲基乙酰胺，甲酰胺和N，N′-二甲基咪唑啉酮的一组物质中选择的。11.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯蒂芬马伯格，彼得J尼斯克恩，理查德L托尔曼，
申请(专利权)人：麦克有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]