核糖体失活蛋白质及其衍生物制造技术

本发明专利技术公开了从苦瓜属（Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ），Ｂｒｙｏｎｉａ．和Ａｓｐａｒａｇｕｓ种植物提取的可用于制备免疫毒素的新的核糖体失活蛋白质。（*该技术在2010年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可用于制备免疫毒素的核糖体失活蛋白质以及它们的疏基衍生物。由植物得到的核糖体失活蛋白质(RIPs)(CancerSurveys1，489，1982;J.NaturalProducts.48，446，1985，FEBSLetters.195，1，1986)使得真核生物核糖体的60s核糖体亚单位催化失活。它们可以是单链蛋白质(RIPS1型)或双链蛋白质(RIPS2型)、其中的一条链具有酶活性而另一条具有半乳糖特异性植物血凝素的性质。RIPs1型较为常见，它存在于许多并且有可能是几乎所有植物的若干部分中，包括种子、根、叶和植物乳汁中，有时以多于一种的形式，可能为异构体形式存在。RIPs具有一个独特的N-糖苷酶活性，并且断裂28srRNA中腺嘌呤4324的N-糖苷键，造成一种损伤，使得RNA可以在由α-sarcin诱导产生的断裂的邻近位点被苯胺裂解。这就使得核糖体不能与延伸因子1或2结合，因而阻碍了蛋白质的合成。尽管它们有许多结构上的相似之处，以及相同的酶活性，但是对于源于不同生物体的核糖体(源于植物、原生动物、昆虫及后生动物)，RIPs具有不同的作用。由于RIPs已用作为“免疫毒素”的成分，所以对它的兴趣愈来愈增加，“免疫毒素”是由连到抗体上去的毒性分子部分组成的杂化分子。免疫毒素将有希望用于消除有害细胞、肿瘤细胞、免疫活性细胞及寄生细胞。这些细胞被认为是可能的靶细胞(CancerImmunol.Immunother27，95，1988)。对RIPs另外的兴趣是来自于它们的抗病毒活性，所有被试验的RIPs都能抑制植物和动物病毒的感染。实际上，首先发现的RIP1型即商陆植物抗病毒蛋白质(PAP)最初纯化为一种抗病毒蛋白质。RIPs的这种性质归因于它更容易穿透到病毒感染的细胞中，因而使这些细胞的核糖体失活，并且阻碍了病毒的繁殖。可是最近发现，一种1型RIP，Trichosanthin，它通过一个显然与对核糖体作用无关的机制，来抑制人类免疫缺陷病毒的复制。有用的是，得到一些用于制备免疫毒素的RIP、得到对一些RIPs具有抗性的细胞起活性作用的共轭物，并且防止因用药后的免疫反应造成的中和作用以及在共轭作用过程中一些RIPs失活所引起的问题。现已发现可以从植物木鳖(MomordicaCochinchinensis)BryoniaDioicaeAsparagusOfficinalis中得到的新的核糖体失活蛋白质。所述植物在先前已被研究过，没有认识到它们里面存在有本专利技术的蛋白质，这种蛋白质的特征是比从同一植物种中提取的已知的类似蛋白质具有显著更高的活性。例如从木鳖(一种产于印度的葫芦科植物)中提取的蛋白质与已知从一些苦瓜属(MomordicaGenus)(苦瓜(MomordiaCharantia))中提取的已知Momordine相比显示出人意料的不同特性。类似的是，从AsparagusofficinalisL.(Biochem.J.216，617，1983)得到的三种糖蛋白是已知的，而从该同种植物中提取的本专利技术物质是具有不同生物和物理化学性质的蛋白质，本专利技术蛋白质的活性在于主要是在无细胞体系中有效地抑制蛋白质的合成尽管对于大多数哺乳动物的细胞毒性很小，但是它们可以通过(用合适的化学试剂)-共轭到合适的载体(“Haptomers”)例如单克隆抗体上，而转化成为高度细胞毒性剂。如果所述载体对肿瘤细胞是抗原特异的，则可以使用所述新的RIPS进行肿瘤细胞的选择性破坏。还发现本专利技术的蛋白质能够在用各种病毒包括人类免疫缺陷病毒(HIV1)忽性传染的培养细胞中抑制病毒的复制。本专利技术还涉及所述RIPs的引入了疏基的衍生物，这种衍生物由式Ⅰ表示。所述衍生物与起始RIPs相比具有相同的或略低的抑制活性，因此，由于它们都是起始RIPs释放到细胞中的免疫毒素与抑制剂的合成中间体，所以对于制备抗体毒素结合物是有用的。(其中Tox表示有关的RIP;Y、R和X的含义见下文)按照常规方法使用双功能试剂得到式Ⅰ的衍生物，这些双功能试剂有例如3，3′-二硫代双丙亚胺酸二甲酯或下面所述的试剂N-琥珀酰亚胺基(succinimidy1)-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)Y X0.5-3(优选0.7-2，最好0.7-1.5)2)-亚胺基硫烷(Iminothiolane)(Traut′s试剂)Y X0.5-2(优选0.5-1，最好0.7)3)S-乙酰基-疏基-琥珀酐(SAMSA)Y X0.2-3(优选0.4-1;最好0.7-1)本专利技术的RIPS将以下列名称表示木鳘因momorcochin(从木鳖种子中得到);bryodine-L泻根因(从Brioniadioica叶中得到);天门冬因1(asparin1)和天门冬因2(asparin2)(从天门冬属ArparagusOfficinalis种子中得到)。木鳖因和泻根因-L是糖蛋白，而天门冬因1和2是蛋白质。通过常规的从植物中提取蛋白质的方法可以得到本专利技术的蛋白质，其特征在下文中被描述。本专利技术蛋白质因此可以通过包括以下各步的方法获得a)研磨和萃取种子或叶;b)将提取物离心或过滤;c)将步骤b的下清液在交联葡糖上进行色谱或进行透析;d)按照合适的顺序进行离子交换色谱和/或凝胶过滤;e)通过透析、冻干、色谱、沉淀或其它常规方法进行最终的纯化。按照已知方法，借助于前面列举的试剂可以将所获得的蛋白质进行修饰。所得衍生物可以用于制备免疫毒素。用于治疗，例如用于治疗肿瘤，这时可以通过非肠道途经采用合适的药物剂型，以1至100mg剂量范围给药。下面的实施例进一步阐述本专利技术。实施例1制备粗提取物将种子在适当的研磨器中湿磨并萃取;将叶和根切成小片，并在萃取前过滤离心，回收汁液并萃取残余物。用0.14M氯化钠/5mM磷酸钠缓冲液PH7.4-7.5，在4-10℃下搅拌12小时进行提取。通过离心使提取物澄清;将按上述方法获得的叶和根的汁加至澄清的混合物中，然后再通过高g离心使其澄清。最终的澄清溶液(“粗提取物”)进行下一阶段的处理。用乙酸将提取物的PH值调至4.2-4.8，例如4.5;放置后形成沉淀，将其离心除去。将澄清的上清液(“酸提取物”)装在S-SepharoseR柱上柱用10mM的乙酸钠缓冲液PH4.5平衡，用同样的缓冲液洗涤并随后用5mM、PH7.5的磷酸钠洗至洗脱液为中性后，用1M氯化钠/磷酸钠缓冲液洗脱该柱。用硫酸铵使澄清的洗脱液饱和;放置后，离心收集沉淀物。将固体溶于5mM、PH7.0的磷酸盐缓冲液中;通过离心使溶液澄清，并将其分离成单一的RIPS(“S-Sepharose渗滤”)或者，所说的最后的提取物的制备也可以通过在4℃、在50-500体积的5mMPH6.5的磷酸盐缓冲液(至少全部更换两次)中透析至少24小时，离心除去每次透析过程中形成的沉淀，并将澄清的提取物进行分离。在“粗提取物”、“酸提取物”、“S-Sephazose渗滤液”这些步骤中，都要对每个RIP进行下文中所述的总蛋白质含量、比活度及总活度的测定。实施例2木鳖因(momorcochin)的分离与性质A)提取与分离按照实施例1中所描述的方法对1.2kg木鳖，一种产于印度的葫芦科种植物的种子进行提取。将最终溶液“S-Se本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由木鳖植物种子制备名为木＊因的核糖体夫活蛋白质的方法，该蛋白质具有下述特征：－－通过凝胶过滤的分子量：３１，０００－－通过电泳的分子量：３０，７００－－等电点：＞９－－在２８０ｎＭ的消光系数：０．７－－ｒＭ＝３０，７ ００的氨基酸组成＊＊＊－－中性糖的总含量：２．８２％－－ｒＭ＝３０，７００的糖组成（ｍｏｌｓ／ｍｏｌ—ＲＩＰ）＊＊＊该方法包括：ａ）磨碎并提取种子；ｂ）将提取物离心；ｃ）在交联葡聚糖上进行色谱；ｄ）离子交 换色谱；ｅ）透析并冷冻干燥。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：费奥林佐，思第皮，路易季，巴比里，佳妮，歌萝莫，
申请(专利权)人：伊塔尔法马科联合股份公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]