本发明专利技术涉及核糖体失活蛋白质，该蛋白质的特征在于它是单链无活性形式的ｐｒｏＲＩＰ，其可被蛋白酶裂解而转化成其活性形式。（*该技术在2011年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
核糖体失活蛋白质(RIP)是能够催化失活真核细胞核糖体，并且是真核细胞蛋白质合成之极有潜力之抑制剂的植物蛋白质。已将RIP分为两类，即1型和2型RIP(参见Barbieri and Stirpe(1982)，Cancer Surveys，1∶489-520)。1型和2型RIP成员之间，以及与也具有同样作用机理的细菌的Shiga和Shiga样毒素之间有着显著的氨基酸序列同源性(参见Hovde et al.，(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85∶2568-2572)。2型RIP由两条多肽链组成;通过二硫键共价结合到凝集素样蛋白质(或B链)上的RIP(或A链)对细胞表面碳水化合物有亲和性。B链与细胞表面结合并有利于继后RIP A链部分的细胞内在化，从而导致蛋白质合成的迅速失活和细胞死亡。因此2型RIP是效力极强的细胞毒素和动物毒剂，其中研究最多的是蓖麻蛋白。相反，迄今所知道的1型RIP则是由一条活性与A链相当的多肽链构成的，而缺少共价结合的B链。因而，它们对完整细胞几乎没有毒性，而保留其极好的抗无细胞蛋白质翻译系统的能力。一般百分之五十抑制无细胞蛋白质翻译的浓度(IC50)为0.5-10ng/ml(0.16-33pM)。在获得下文详述的发现之前，已报导1型RIP与分子量约30，000的碱性蛋白质有显著的同源性。1型RIP可见于多种双子叶和单子叶植物中，并可能是普遍存在的。如在植物的种子、根和乳胶细胞中存在有丰富的蛋白质。它们的体内功能尚不明了，但已有报导它们可能是抗病毒剂(Stevens et al.，(1981)，Experientia，37∶257-259)或抗真菌剂(Roberts and Seltrennikkoff(1986)，Bioscience Reports 6∶19-29)。迄今为止，已有一篇文章讨论了玉米，以及其它谷物中存在有动物无细胞蛋白合成抑制剂(Coleman and Roberts(1982)，Bio-chimica et Biophysica Acta，696∶239-244)。玉米抑制剂是通过硫酸铵沉淀和磷酸纤维素柱层析法制备的。据信可从玉米中分离到纯的抑制剂。报导的抑制剂分子量为23千道尔顿(KD)，且用腹水无细胞蛋白质合成检测法测知ⅠC50为50-100ng/ml。已检测了RIP对核糖体的作用，发现1型和2型RIP均具有独特的而且高度特异的N-葡萄苷酶活性，该酶可裂解大鼠肝核糖体28S RNA之腺嘌呤4324的糖苷键(Endo(1988)，Immuno-toxins，(ed.)Frankel)。对RIP的商业兴趣主要集中在将它们与击靶多肽，如最常用的单克隆抗体相结合，用于构建针对特定细胞如肿瘤细胞的治疗性毒素(Immunotoxins(1988)，同上)。这一结合产物模拟了2型RIP之B链的结合功能性，但用高度选择的配基置换了它们的非特异性作用。最近发现的另一个潜在应用是用于治疗HIV感染(见美国专利4，869，903号Lifsou等人，(Genelabs Incorporated and Regents of the University of California))。虽然玉米得到的蛋白质合成抑制剂，同由其他禾本科(panicoi-deae)制得的蛋白质合成抑制剂一样似乎可用于构建细胞毒性结合物物，但迄今还没有那一个研究人员报导已成功地使用了禾本科(pani-coideae)RIP。从使用包括大麦等谷物在内的非禾本科植物RIP获得成功的角度看，这是颇令人惊奇的(参见Lambert et al.，(1988)，In∶Immunotoxins，同上)。迄今本领域人员尚未能按Coleman和Roberts所述成功地利用玉米RIP，其部分原因可能由于尚未完全确定蛋白质合成抑制物的特性。对于在通用宿主真核细胞中表达重组体RIP有兴趣，是因为其具有提供正确的转译后加工的能力。然而，因于RIP会在真核细胞内有效地抑制蛋白质合成，故推断可能存在异源表达RIP会导致宿主细胞死亡的问题。因此，一般不使用真核细胞作为重组体宿主细胞。虽然可在某些条件下使用真核细胞，但构建RIP时必须使其在细胞受到毒性作用之前分泌出来(参见Gelfand等人(Cetus公司)的欧洲专利EP0335476号)。因此，尽管存在不能糖基化并适当地折迭异源表达的蛋白质等缺点，大多仍使用原核宿主细胞作为宿主。因此本专利技术的一个目的是提供一种制备无活性形式RIP的方法，其中可由真核宿主细胞表达无活性的RIP，然后将其转化为活性形式。本专利技术的另一个目的是提供编码至少一种无活性形式RIP之基因的DNA序列，以及含有这一DNA序列的表达载体、宿主细胞及细胞培养物。本专利技术的其他目的和优点将会从下面的叙述中了解到。本专利技术所涉及的是这些目的第一个方面，本专利技术涉及一种称为proRIP的同源蛋白质，其中该蛋白质不能在实质失活真核细胞核糖体，但它可被转化成能够在实质上失活真核细胞核糖体的称为αβRIP的蛋白质，所说的proRIP具有可移动的、内部肽接头序列。第二个方面，本专利技术涉及来源于禾本科的称为proRIP的同源蛋白质，其中proRIP具有可除去的内部肽接头序列，而且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但在除去接头后其可被转化成定名为αβRIP、具有α和β片段的能够在实质上失活真核细胞核糖体的蛋白质。第三个方面，本专利技术涉及来源于禾本科称为αβRIP的同源蛋白质，其能够在实质上失活真核细胞核糖体、且其中RIP具有α和β片段。在第四个方面，本专利技术涉及从玉米得到的称为proRIP的同源蛋白质，其中proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但当除去接头后其可被转化成具有α和β片段的定名为αβRIP的蛋白质后，便能够在实质上失活真核细胞核糖体，所说的α片段具有有效地同源于下示序列的氨基酸序列 且所说的β片段具有有效地同源于下示序列的氨基酸序列 第五个方面，本专利技术涉及将不能在实质上失活真核细胞核糖体之蛋白质转化成能够在实质上失活真核细胞核糖体之蛋白质的方法，所说的方法包括下列步骤a)提供一种来源于禾本科称为proRIP的同源蛋白质，该proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但经除去该接头后其可被转化成具有α和β片段称为αβRIP的蛋白质，它能够在实质上失活真核细胞核糖体;以及b)使proRIP与一种能删除接头部分的裂解剂接触，以生成能够在实质上失活真核细胞核糖体具有α和β片段称为αβRIP的蛋白质。第六个方面，本专利技术涉及含有击靶载体和来源于禾本科称为proRIP的蛋白质的结合物，其中proRIP具有一个可除去的内部肽接头序列，而且不能在实质上失活真核细胞核糖体，但经除去该接头后其可被转化成能够在实质上失活真核细胞核糖体具有α和β片段称为αβRIP的蛋白质。第七个方面，本专利技术涉及包含击靶载体与来源于禾本科称为αβRIP的蛋白质的结合物，其能够在实质上失活真核细胞核糖体，其中αβRIP具有α和β片段。第八个方面，本专利技术涉及包含击靶载体和来源于玉米的称为proRIP之蛋白质的结合物，其中proRIP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种称为ｐｒｏＲＩＰ的基本上纯的蛋白质，其中该蛋白不能在实质上失活真核细胞核糖体，但其可被转化成称为ＲＩＰ，能在实质上失活真核细胞核糖体的蛋白质，所说的ｐｒｏＲＩＰ具有一个可除去的内部肽接头序列。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：特伦斯A沃尔什，蒂莫西D海伊，爱丽斯ER摩根，
申请(专利权)人：道伊兰科公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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