使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统改变农学性状及其使用方法技术方案

本发明专利技术提供了组合物和方法以用于植物或植物细胞的基因组中靶序列的农学性状改变。该方法和组合物使用向导RNA/Cas内切核酸酶系统以提供修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组区域内靶位点的有效系统，从而提供所需的农学性状诸如干旱、收率和胁迫耐受性的改善。本发明专利技术还公开了利用双组分RNA向导和Cas内切核酸酶系统来选择植物的育种方法。本发明专利技术还提供了用于编辑细胞的基因组中核苷酸序列的组合物和方法。

Use the wizard RNA/CAS endonuclease system to alter agronomic traits and how they are used

The present invention provides compositions and methods for agronomic character change in target sequences of plant or plant cells. The methods and compositions using the wizard RNA/Cas endonuclease system to provide an effective system of region of the genome modification or change plants, plant cells or seed in the target site, so as to provide the desired agronomic traits such as drought, yield and stress tolerance improvement. The invention also discloses a breeding method for selecting a plant by using a two-component RNA guide and an Cas endonuclease system. The present invention also provides compositions and methods for editing nucleotide sequences in a genome of a cell.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用向导RNA/CAS内切核酸酶系统改变农学性状及其使用方法相关专利申请的交叉引用本专利申请要求2014年7月11日提交的美国临时申请62/023239的优先权，所述临时申请全文以引用方式并入本文。
本专利技术涉及植物分子生物学领域，具体涉及用于改变植物细胞的基因组的方法。
技术介绍
重组DNA技术已使得可以将外来DNA序列插入生物体的基因组中，从而改变该生物体的表型。最常用的植物转化方法是农杆菌属(Agrobacterium)感染和基因枪粒子轰击，在这些方法中转基因以随机方式和以不可预测的拷贝数整合进植物基因组中。因此，人们作出努力来控制植物中的转基因整合。一种用于插入或者修饰DNA序列的方法涉及通过引入侧接有与基因组靶标同源的序列的转基因DNA序列来进行的同源DNA重组。虽然已开发出了几种方法来靶向植物基因组中的特定位点以进行修饰，但对用于产生具有改变的基因组的能育植物的更高效和有效的方法仍存在需求，该改变的基因组包含位于该植物基因组的限定区域中的特异性修饰。
技术实现思路
本专利技术提供了在植物中利用向导RNA/CAS内切核酸酶系统的组合物和方法，从而对植物或植物细胞的基因组中的靶序列(涉及改善植物的农学性状)进行基因组修饰，选择植物，编辑基因，以及将目的多核苷酸插入植物基因组中。该方法和组合物利用向导RNA/CAS内切核酸酶系统来提供修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内靶位点和目的核苷酸的有效系统。一旦鉴定基因组靶位点，就可利用多种方法进一步修饰靶位点，由此使得其可包含多种目的多核苷酸。本专利技术还公开了育种方法和用于利用双组分RNA向导和Cas内切核酸酶系统来选择植物的方法。本专利技术还提供了具有向导RNA/Cas内切核酸酶系统的核酸构建体、植物、植物细胞、外植体、种子和谷物。本专利技术还提供了利用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统的组合物和方法，从而对细胞或生物体的基因组中的靶序列进行基因组修饰，基因编辑，以及将目的多核苷酸插入细胞或生物体的基因组中或使来自于细胞或生物体的基因组的目的多核苷酸缺失。该方法和组合物利用向导多核苷酸/Cas内切核酸酶系统以提供修饰或改变靶位点和编辑细胞基因组内的目的核苷酸序列的有效系统，其中向导多核苷酸由RNA序列、DNA序列、或DNA-RNA组合序列组成。在一个实施方案中，一种改善植物的农学性状的方法，该方法包括：提供靶向改善植物的一个或多个农学特性中所涉及的多核苷酸的向导RNA，该向导RNA与在多核苷酸中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联；以及生成植物，其中该植物表现出农学性状的改善。在一个实施方案中，本专利技术还公开了与对应的内源性未修饰的基因组DNA相比包括一个或多个核苷酸变化的供体多核苷酸。在一个实施方案中，供体多核苷酸不编码全长蛋白质。在一个实施方案中，供体多核苷酸包含异源调控元件。在一个实施方案中，调控元件包含启动子。在一个实施方案中，调控元件包含增强子元件。在一个实施方案中，增强子元件来源于植物。在一个实施方案中，多核苷酸选自调控元件、5’-UTR、内含子、外显子、编码序列和启动子。在一个实施方案中，异源调控元件来自于与改善植物的一个或多个农学特性中所涉及的多核苷酸相同的植物物种。在一个实施方案中，向导RNA靶向选自涉及ZmArgos8、ZmACS6、ZmSRTF18、ZmXERICO1、海藻糖-6-磷酸酯磷酸酶(T6PP)和ZmSTPP3的表达的多核苷酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，农学特性选自非生物胁迫耐受性。在一个实施方案中，非生物胁迫耐受性为干旱或缺乏营养物质。在一个实施方案中，农学特性为收率的增大或耐旱性的增加。在一个实施方案中，Cas9内切核酸酶在多核苷酸的编码区域中产生双链断裂。在一个实施方案中，植物选自玉米、大豆、稻、小麦、高粱、芸苔属、向日葵和亚麻荠。一种改善玉米植物的谷物收率的方法，该方法包括：提供靶向涉及乙烯生物合成或乙烯信号化的多核苷酸的向导RNA，该向导RNA与在该多核苷酸中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联地起作用；以及生成植物，其中玉米植物表现出改善的谷物收率。在一个实施方案中，与涉及乙烯生物合成或乙烯信号化的多核苷酸的对应的内源性未修饰的基因组DNA相比，供体多核苷酸包括一个或多个核苷酸变化。在一个实施方案中，多核苷酸为玉米ACC合酶。在一个实施方案中，多核苷酸为玉米ARGOS。在一个实施方案中，玉米ACC合酶的表达相比于对照玉米植物降低。在一个实施方案中，玉米ARGOS相比于对照玉米植物增加。在一个实施方案中，玉米ARGOS通过插入异源调控元件而增加。一种改善玉米植物的谷物收率或氮利用效率的方法，该方法包括：提供靶向调控编码丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶的多核苷酸的表达的基因组区域的向导RNA，该向导RNA与在该基因组区域中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联地起作用；以及生成玉米植物，其中该玉米植物表现出改善的谷物收率或氮利用效率。在一个实施方案中，丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶为ZmSTPP3。在一个实施方案中，ZmSTPP3的表达相比于对照玉米植物增加。在一个实施方案中，ZmSTPP3的表达通过插入异源调控元件来增加。在一个实施方案中，异源调控元件为中等组成型启动子。在一个实施方案中，异源调控元件来源于玉米。一种改善玉米植物的谷物收率或氮利用效率的方法，该方法包括：提供靶向玉米植物的基因组区域的向导RNA以引入多核苷酸的一个或多个变化，从而生成雄性能育性减少的显性表型，该向导RNA与在该基因组区域中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联地起作用；以及生成玉米植物，其中当通过包括大量能育花粉的玉米植物受精时，该玉米植物表现出减少的雄性能育性和由此改善的谷物收率或氮利用效率。在一个实施方案中，雄性能育性减少。在一个实施方案中，玉米植物是良种近交或杂交玉米植物。在一个实施方案中，MS44多肽在对应于信号肽裂解位点的位置处具有突变。在一个实施方案中，信号肽裂解位点位于未加工的MS44多肽的约38位氨基酸或39位氨基酸。一种改善作物植物的谷物收率或氮利用效率的方法，该方法包括：提供靶向植物的基因组区域的向导RNA以引入编码与SEQIDNO：554具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸的一个或多个变化，从而生成雄性能育性减少的显性表型，该向导RNA与在该基因组区域中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联地起作用；以及生成植物，其中当通过包括大量能育花粉的能育植物受精时，该植物表现出减少的雄性能育性和由此改善的谷物收率或氮利用效率。在一个实施方案中，植物选自稻、小麦和高粱。在一个实施方案中，植物是能够转化的良种品种。在一个实施方案中，MS44多肽在对应于信号肽裂解位点的位置处具有突变。在一个实施方案中，植物在氮减少的环境中生长。在一个实施方案中，该多肽与SEQIDNO：554具有约90％的同一性。在本公开的一个实施方案中，该方法包括用于选择在其植物基因组中包含改变的靶位点的植物的方法，该方法包括：a)获得第一植物，该第一植物包含至少一种能够在植物基因组的靶位点处引入双链断裂的Cas内切核酸酶；b)获得第二植物，该第二植物包含能够与(a)的Cas内切核酸酶形成复合物的向导RNA，c)使(a)的第一植物与(b)的第二植物杂交；d)评估(c)的子代本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种改善植物的农学性状的方法，所述方法包括：提供向导RNA，所述向导RNA靶向改善植物的一个或多个农学特性中所涉及的多核苷酸，所述向导RNA与在所述多核苷酸中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联；以及生成所述植物，其中所述植物表现出农学性状的改善。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.07.11 US 62/0232391.一种改善植物的农学性状的方法，所述方法包括：提供向导RNA，所述向导RNA靶向改善植物的一个或多个农学特性中所涉及的多核苷酸，所述向导RNA与在所述多核苷酸中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联；以及生成所述植物，其中所述植物表现出农学性状的改善。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括与对应的内源性未修饰的基因组DNA相比包括一个或多个核苷酸变化的供体多核苷酸。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述供体多核苷酸不编码全长蛋白质。4.根据权利要求2所述的方法，其中所述供体多核苷酸包含异源调控元件。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述调控元件包含启动子。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述调控元件包含增强子元件。7.根据权利要求6所述的方法，其中所述增强子元件来源于植物。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸选自调控元件、5’-UTR、内含子、外显子、编码序列和启动子。9.根据权利要求4所述的方法，其中所述异源调控元件来自于与改善所述植物的一个或多个农学特性中所涉及的多核苷酸相同的植物物种。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述向导RNA靶向选自涉及ZmArgos8、ZmACS6、ZmSRTF18、ZmXERICO1、海藻糖-6-磷酸酯磷酸酶(T6PP)和ZmSTPP3的表达的多核苷酸序列的多核苷酸。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述农学特性选自非生物胁迫耐受性。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述非生物胁迫耐受性为干旱或缺乏营养物质。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述农学特性为收率的增大或耐旱性的增加。14.根据权利要求1所述的方法，其中Cas9内切核酸酶在所述多核苷酸的编码区域中产生双链断裂。15.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物选自玉米、大豆、稻、小麦、高粱、芸苔属、向日葵和亚麻荠。16.一种改善玉米植物的谷物收率的方法，所述方法包括：提供向导RNA，所述向导RNA靶向涉及乙烯生物合成或乙烯信号化的多核苷酸，所述向导RNA与在所述多核苷酸中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联地起作用；以及生成所述植物，其中所述玉米植物表现出改善的谷物收率。17.根据权利要求16所述的方法，所述方法还包括与涉及乙烯生物合成或乙烯信号化的所述多核苷酸的对应的内源性未修饰的基因组DNA相比，包括一个或多个核苷酸变化的供体多核苷酸。18.根据权利要求16所述的方法，其中所述多核苷酸为玉米ACC合酶。19.根据权利要求16所述的方法，其中所述多核苷酸为玉米ARGOS。20.根据权利要求18所述的方法，其中所述玉米ACC合酶的表达相比于对照玉米植物降低。21.根据权利要求19所述的方法，其中所述玉米ARGOS的表达相比于对照玉米植物增加。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述玉米ARGOS的表达通过插入异源调控元件来增加。23.根据权利要求22所述的方法，其中所述异源调控元件为中等组成型启动子。24.根据权利要求22所述的方法，其中所述异源调控元件来源于玉米。25.一种改善玉米植物的谷物收率或氮利用效率的方法，所述方法包括：提供向导RNA，所述向导RNA靶向调控编码丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶的多核苷酸的表达的基因组区域，所述向导RNA与在所述基因组区域中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联地起作用；以及生成所述玉米植物，其中所述玉米植物表现出改善的谷物收率或氮利用效率。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶为ZmSTPP3。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述ZmSTPP3的表达相比于对照玉米植物增加。28.根据权利要求26所述的方法，其中所述ZmSTPP3的表达通过插入异源调控元件来增加。29.根据权利要求28所述的方法，其中所述异源调控元件为中等组成型启动子。30.根据权利要求28所述的方法，其中所述异源调控元件来源于玉米。31.一种改善玉米植物的谷物收率或氮利用效率的方法，所述方法包括：提供靶向所述玉米植物的基因组区域的向导RNA以引入多核苷酸的一个或多个变化，从而生成雄性能育性减少的显性表型，所述向导RNA与在所述基因组区域中产生双链断裂的Cas内切核酸酶相关联地起作用；以及生成所述玉米植物，其中当通过包括大量能育花粉的玉米植物受精时，所述玉米植物表现出减少的雄性能育性和由此改善的谷...

【专利技术属性】
技术研发人员：史金瑞，郜会荣，牛小牧，
申请(专利权)人：先锋国际良种公司，
类型：发明
国别省市：美国,US