用于监测组织蛋白酶S抑制的方法技术

本发明专利技术涉及用于监测动物组织样品中的组织蛋白酶S抑制剂活性的方法，其包括：a)提供已对其施用组织蛋白酶S抑制剂的动物的组织样品，或提供在体外与组织蛋白酶S抑制剂接触过的动物组织样品，其中组织样品包含白细胞；b)通过流式细胞术测量步骤a)的组织样品的白细胞中的li p10肽水平；和c)使白细胞中的li p10肽水平与组织蛋白酶S抑制剂剂量关联，其中组织蛋白酶S抑制剂导致白细胞中li p10肽水平提高。

Methods for monitoring cathepsin S inhibition

The invention relates to a method for monitoring, animal tissue samples of cathepsin S inhibitor activity includes: a) provides has its application of cathepsin S inhibitors animal tissue samples, or provide contact in vitro and cathepsin S inhibitor animal tissue samples, including tissue samples containing white blood cells; b) by flow cytometry. Operation measurement procedures a) tissue samples of white blood cells in the Li P10 peptide level; and C) the Li P10 peptide and cathepsin S inhibitor dose of white blood cells in association, which lead to Li cathepsin S inhibitor P10 peptide levels in white blood cells increased.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于监测组织蛋白酶S抑制的方法本专利技术提供抗lip10肽的抗体及其在用于监测组织蛋白酶S抑制的方法中的用途。组织蛋白酶S因其在蛋白水解消化不变链蛋白伴侣分子，从而控制抗原通过主要组织相容性复合体(MHC)II类分子呈递给CD4+T细胞或通过CD1分子呈递给NK1.1+T细胞中的重要功能而闻名。组织蛋白酶S似乎还参与通过MHCII类呈递给CD4+T细胞的外源抗原的直接加工，或参与通过MHCI类分子交叉呈递给CD8+T细胞。此外，组织蛋白酶S以其分泌形式涉及胞外基质降解，这可促成许多疾病的病理，包括关节炎、动脉粥样硬化和慢性阻塞性肺疾病。因此，对于开发用于多种适应症的新治疗剂，组织蛋白酶S的抑制是有前景的靶标。MHCII类分子结合并展示抗原肽，作为抗原呈递细胞(APC)的细胞表面上的由CD4+辅助细胞识别的II类-肽复合体。导致形成II类-肽复合体并在细胞表面呈递抗原的分子机制始于内质网中的II类αβ异二聚体合成。在生物合成期间，这些αβ异二聚体与II型膜蛋白(不变链li的同种型)结合，形成αβli的九聚复合体。αβli复合体穿过高尔基体，递送至胞内区室。在这些酸性区室中，li被降解，并最终从αβli复合体释放，允许II类分子结合抗原肽。li的蛋白水解加工产生更短的片段。在APC中，半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶S在加工li中发挥关键作用。组织蛋白酶S降解来自II类-li复合体的的不变链li，产生II类-CLIP。因此，组织蛋白酶S的抑制导致CLIP肽减少，前体片段(即不变链li降解肽p10(lip10))累积。EP1315966公开了用于监测体内施用组织蛋白酶S抑制剂的作用的方法。该方法包括从用组织蛋白酶S抑制剂处理的个体的血样纯化白细胞，制备所纯化的白细胞的全细胞裂解物，并针对不变链li的lip10片段的存在分析全细胞裂解物。此方法需要约10-30ml血样，且耗费劳力(分离白细胞和制备全细胞裂解物)。lip10的检测通过ELISA或Western印迹进行。本专利技术的目的是提供监测组织蛋白酶S抑制的测定，该测定克服现有技术方法的至少一些缺点。在第一目的中，本专利技术提供用于监测动物组织样品中的组织蛋白酶S抑制剂活性的方法，其包括：a)提供已对其施用组织蛋白酶S抑制剂的动物的组织样品，或提供在体外与组织蛋白酶S抑制剂接触过的动物组织样品，其中组织样品包含白细胞；b)通过流式细胞术测量步骤a)的组织样品的白细胞中的lip10肽水平；和c)使白细胞中的lip10肽水平与组织蛋白酶S抑制剂剂量关联，其中组织蛋白酶S抑制剂导致白细胞中lip10肽水平提高。在第二目的中，本专利技术提供用于鉴定组织蛋白酶S抑制剂的方法，其包括：a)用测试化合物处理非人动物；b)提供步骤a)的动物的包含白细胞的组织样品；c)测量步骤b)的组织样品的白细胞中的lip10肽水平；其中与未经处理的动物的组织样品中的白细胞中lip10肽的水平相比，步骤a)的样品中的白细胞中lip10肽水平的提高指示组织蛋白酶S抑制剂。在本专利技术方法的优选实施方案中，该组织样品是血液。在本专利技术方法的另一优选实施方案中，该白细胞是抗原呈递细胞(APC)，优选地，该APC选自B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞，更优选选自B细胞和单核细胞。本文所用的术语抗原呈递细胞(APC)指将抗原肽作为(MHC)II类-抗原肽复合体展示在其表面的细胞。APC包括树突细胞、单核细胞、巨噬细胞和B细胞。在第三目的中，本专利技术提供抗lip10抗体，其包含：包含含有氨基酸序列Seq.Id.No.4的CDR1、含有氨基酸序列Seq.Id.No.5的CDR2、含有氨基酸序列Seq.Id.No.6的CDR3的VH结构域，及包含含有氨基酸序列Seq.Id.No.7的CDR1、含有氨基酸序列Seq.Id.No.8的CDR2、含有氨基酸序列Seq.Id.No.9的CDR3的VL结构域。在本专利技术的具体实施方案中，抗lip10抗体的VH结构域包含氨基酸序列Seq.Id.No.10，抗lip10抗体的VL结构域包含氨基酸序列Seq.Id.No.11.本专利技术的抗li-p10特异性抗体在本文中称为源自家兔(Oryctologouscuniculus)的7B8新表位抗体。此抗体的特征在于Seq.Id.No.4-11中所公开的CDR和VH、VL序列。术语组织蛋白酶S指木瓜蛋白酶超家族中的半胱氨酸蛋白酶。人组织蛋白酶S的氨基酸序列在Seq.Id.No.1中提供。术语“不变链li”指主要组织相容性复合体或CD74的不变多肽。人不变链li的氨基酸序列在Seq.Id.No.2中提供。术语lip10肽指II类结合li肽。人lip10的氨基酸序列在Seq.Id.No.3中提供。本文所用的术语“MHCII多肽”指组成MHCII复合体的α链和β链。本文所用的术语动物包括人类和非人动物，如猴、狗、猪、兔、豚鼠和啮齿动物。本文在与本专利技术的测定结合描述的“测试化合物”或“候选药物化合物”的背景中使用术语“化合物”。因此，这些化合物包括合成来源或来自自然来源的有机或无机化合物。化合物包括无机或有机化合物，如多核苷酸、脂质或表征为相对低的分子量的激素类似物。其他生物聚合有机测试化合物包括含有约2至约40个氨基酸的肽和含有约40至约500个氨基酸的更大的多肽，如抗体或抗体缀合物。本专利技术的专利技术人惊奇地发现，可以在白细胞中检测lip10肽。与现有技术中所述的方法相比，本专利技术的方法具有可以直接测定组织样品(优选血液)而不涉及分离白细胞的优势。在本专利技术的方法中，无需为了能够在本专利技术的方法中处理而从全血样品分离例如白细胞。如果在必须处理大量样品的临床环境中使用，则这具有重要意义。本专利技术的方法需要比现有技术方法小的组织样品，优选血样。用于检测和/或测量生物样品中的多肽的方法为本领域公知，包括但不限于Western印迹、流式细胞术、ELISA或RIA、或多种蛋白质组学技术。可以为了检测多肽或肽片段的目的而例如通过用纯化的蛋白质免疫兔来产生识别lip10肽或其片段的单克隆或多克隆抗体，或者可以使用识别多肽或肽片段的已知抗体。例如，在Western印迹中，可以用能够结合变性蛋白质的抗体(如多克隆抗体)来检测LIP10肽或MHCII多肽。ELISA是测量多肽的方法的实例。此类蛋白质定量基于能够捕获特异性抗原的抗体和能够检测所捕获的抗原的第二抗体。用于制备和使用抗体的方法及上文提到的测定描述于Harlow,E.和Lane,D.Antibodies:ALaboratoryManual,(1988),ColdSpringHarborLaboratoryPress中。用于检测lip10肽的优选方法是流式细胞术。流式细胞术方法描述于HandbookofFlowCytometryMethod,J.PaulRobinson(编辑)；FlowCytometry-ABasicIntroduction,MichaelGOrmerod(2008)和CurrentProtocolsinCytometry(2010),Wiley中。在此方法中，蛋白质不变性，而是保持其天然形式。WO2010/121918公开了可在本专利技术的方法中测试的组织蛋白酶S抑制剂。附图简述图1：用新表位抗体检测B细胞和本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于监测动物组织样品中的组织蛋白酶S抑制剂活性的方法，其包括：a)提供已对其施用组织蛋白酶S抑制剂的动物的组织样品，或提供在体外与组织蛋白酶S抑制剂接触过的动物组织样品，其中组织样品包含白细胞；b)通过流式细胞术测量步骤a)的组织样品的白细胞中的li p10肽水平；和c)使白细胞中的li p10肽水平与组织蛋白酶S抑制剂剂量关联，其中组织蛋白酶S抑制剂导致白细胞中li p10肽水平提高。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.09.18 EP 14185409.11.用于监测动物组织样品中的组织蛋白酶S抑制剂活性的方法，其包括：a)提供已对其施用组织蛋白酶S抑制剂的动物的组织样品，或提供在体外与组织蛋白酶S抑制剂接触过的动物组织样品，其中组织样品包含白细胞；b)通过流式细胞术测量步骤a)的组织样品的白细胞中的lip10肽水平；和c)使白细胞中的lip10肽水平与组织蛋白酶S抑制剂剂量关联，其中组织蛋白酶S抑制剂导致白细胞中lip10肽水平提高。2.用于鉴定组织蛋白酶S抑制剂的方法，其包括：a)使非人动物与测试化合物接触；b)提供步骤a)的动物的包含白细胞的组织样品；c)通过流式细胞术测量步骤b)的组织样品的白细胞中的lip10肽水平；其中与未经处理的动物的组织样品中的白细胞中lip10肽的水平相比，步骤a)的样品中的白细胞中lip10肽水平的提高指示组织蛋白酶S抑制剂。3.权利要求1或2的方法，其中组织样品是血液。4.权利要求1至3的方法，其中白细胞是抗原呈递细胞(APC)，优选B细胞、单核...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·P·本托珀雷拉达席尔瓦，S·德兹阿德克，B·埃萨伯特，M·耶格，E·诺戈采克，M·马尔齐诺夫斯基，B·雷斯，T·申德勒，M·A·E·西伦，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH