生物活性成分和细胞靶向成分为预定比例的、基本为均质的生物活性材料以及该材料的制备和使用方法技术

一种用于靶向和治疗患病细胞的均质缀合物及其制备方法，其中缀合物具有预定比例的药物／蛋白，所述蛋白可以特异性结合这些细胞。制备这种缀合物的方法包括按一定方式将药物分子加到连接子分子中，使得一分子药物连接一分子连接子，然后将药物／连接子复合体加到蛋白分子中，使得药物分子／蛋白分子达预定比例。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术概括地涉及生物活性材料领域。更具体而言，本专利技术涉及基本为均质的蛋白-药物缀合物及其制备和使用方法。
技术介绍
在癌症治疗中最致命的两个问题是药物毒性问题和抗药性问题。药物毒性使患者身体虚弱，而抗药性问题甚至在更高剂量水平下也常常会遇到，从而放大了药物的毒副作用，由此经常导致患者死亡。解决药物毒性问题的一个方法是仅针对肿瘤细胞进行靶向给药。许多研究者正在致力于开发用于转运药物的抗体并取得了可喜的进展。但抗体也并非是不存在问题的，例如，抗体常常与正常组织结合，而且它们也会损伤血管(如血液渗漏综合症)或造成严重的变态反应(如过敏)。如美国专利5,108,987、5,000,935、4,895714和4,886,780中所述，有关运铁蛋白和抗癌药物缀合物之应用方面的研究也取得了进展。这些专利中描述的专利技术没有采用抗体，而是利用了一种在正常人体血液中存在的蛋白，这种蛋白就是转运铁的运铁蛋白。正常细胞很少需要铁，但肿瘤细胞需要大量的铁，以满足其病态增加的新陈代谢需要。由于肿瘤细胞需要更多的铁，其表面存在着差不多为永久性的运铁蛋白受体，而正常细胞表面则不存在这种受体。上述专利技术利用了这些受体，通过给药键合在运铁蛋白上的抗癌药物，将药物基本上都转运至肿瘤细胞表面的运铁蛋白受体之上。靶向给药绕开了正常细胞，允许使用更小剂量的药物，从而明显缓解了药物毒性的问题。反之，当抗癌药物以非靶向给药的方式给药时，它们同时杀灭正常细胞和肿瘤细胞。这些药物对于免疫系统的细胞和负责血液凝固的系统的毒性特别强，所以癌症患者在化疗期间的主要并发症是感染和出血。治疗这些并发症需要昂贵的设施、住院、重症看护和生命支持系统，对于患者而言不仅身体不适并且昂贵，而采用靶向给药系统则可以在很大程度上避免这些问题的出现。药物毒性问题消耗了医护人员大量的时间，这是癌症治疗的花费中的主要组成部分。例如，一般认为肿瘤科医生中约70％的求救电话与药物毒性有关。目前，除了降低药物用量以外，对于药物毒性问题尚无令人满意的解决办法。靶向给药允许使用更小剂量的药物，因为大部分药物可以被特异性地转运至肿瘤细胞内，而不是非特异性地分布于全身。从这一角度看，靶向给药就象是用来复枪射击，而常规给药方法则象是用机枪进行扫射。药物毒性问题的解决将使癌症患者的化疗发生重大的变革。本专利技术的目标之一就是降低化疗中的毒副作用。与药物毒性相比，抗药性也是同样严重的问题。典型的情况是这样的，确诊患有癌症的患者接受治疗并在数月的时间内病情好转，无症状出现，但随后肿瘤重新出现，而且任何已知药物均不再有效。诸如此类的抗药性问题非常普遍，至今尚无令人满意的解决方案。只有采用更大剂量和药力更强的药物进行治疗，但反过来这又会造成更为严重的药物毒性问题，常常会导致患者死亡。抗药性问题的解决将大大缓解药物毒性问题。运铁蛋白靶向给药可以克服抗药性的问题。因此，本专利技术的另一个目标是解决痛苦的且经济负担沉重的由抗药性癌症造成死亡的问题。与生物活性分子缀合的蛋白的疗效已经得到了证明，并且在上述美国专利中已经作了描述。但是，现已证明在应激细胞如肿瘤细胞的治疗中，当出现缀合物聚集以及生物活性分子与蛋白片断或者与二至三个蛋白构成缀合物的情况时，这种缀合物的药效会被消弱。而蛋白和生物活性分子的比例接近1∶1时，缀合物的药效会大幅提高。以前为获得药效较高的缀合物，需要采用费时、费工和昂贵的处理工序，从包含有生物活性分子和蛋白片断构成的缀合物、生物活性分子和多个蛋白构成的缀合物以及多个生物活性分子和蛋白构成的缀合物的样品中分离得到生物活性分子/蛋白比例理想的缀合物。采用均质的蛋白-药物缀合物可以更为有效地杀灭抗药性肿瘤细胞和药物敏感的肿瘤细胞，在这种均质的蛋白-药物缀合物中蛋白成分负载有预定数量的生物活性分子。此前，规模化生产有明显疗效的缀合物的方法存在成本高、效率低的问题，造成这种缀合物难以商品化和广泛使用。对于基本为均质的药物-蛋白缀合物，以及高效、精确和价廉地制备这种缀合物的方法存在现实的需要。本专利技术的一个目标是通过有效的方法提供这种均质的缀合物。1980年，Faulk和他的同事首次报道了人类肿瘤细胞中存在运铁蛋白受体(1)。参见下表，以下为运铁蛋白受体存在于不同类型人类肿瘤中的报道。 存在于正常细胞和肿瘤细胞中的运铁蛋白受体现尚无一项研究去探究是否所有的人类肿瘤均上调了运铁蛋白受体的数量，而所有正常细胞均下调了运铁蛋白受体的数量，但分析各方面的数据后，对于这两个问题的回答是肯定的。例如，未成熟的红细胞(即正母红细胞和网状细胞)在其表面上存在运铁蛋白受体，但成熟红细胞中没有(17)。循环系统中的单核细胞也没有上调运铁蛋白受体的数量(18)，而巨噬细胞(包括肝巨噬细胞)通过噬红细胞作用以运铁蛋白依赖性的方式获得所需的大部分铁(19)。事实上，体内研究表明网状内皮系统几乎不从血浆运铁蛋白中得到铁(有关综述参见文献20)。细胞因子(如γ干扰素)下调了巨噬细胞运铁蛋白受体的数量(21)，推测这种限制铁吸收的机制可以作为杀灭细胞内寄生物的一种解释(22)。在休眠的淋巴细胞中，不仅运铁蛋白受体数量被下调，而且也检测不到运铁蛋白受体的基因(23)。与之相反，受激淋巴细胞在G1后期上调了运铁蛋白受体的数量(24)。随c-myc原致肿瘤基因的表达以及随后的IL-2受体的上调，出现了运铁蛋白受体的表达(25)，同时伴随铁调控蛋白结合能力的明显增加(26)，这种增加稳定了运铁蛋白受体的mRNA(27)。对于T型和B型淋巴细胞这种现象均存在(28)，并且是一种IL-2依赖的响应(29)。众所周知，造成运铁蛋白受体上调的细胞刺激源自所遭受到的刺激，如细胞受病毒或肿瘤细胞的入侵。通过抗原或凝集素刺激的研究(即受体上调)以及采用视黄酸进行的分化模式的研究(即、受体下调)(30-33)，已经证明了正常和肿瘤细胞中运铁蛋白受体数量的上调和下调。这些试验模型所得到的基线数据表明大多数正常、成熟和休眠的人类细胞的质膜上的受体数量被下调(34)。例外的是循环系统中的屏障系统，包括母婴屏障，其中含有富含运铁蛋白受体的合胞滋养层(35)；血脑屏障，其中含有富含运铁蛋白受体的毛细内皮细胞(36)；以及血液睾丸屏障，其中含有富含运铁蛋白受体的支持细胞(37)。运铁蛋白-药物缀合物杀灭细胞的机制通过连续的两个反应，运铁蛋白-多柔比星缀合物与质膜结合首先，运铁蛋白成分与运铁蛋白受体结合，然后主要利用心磷脂和带电磷酸酯间的相互作用，多柔比星与脂质双分子层结合(58)。因此，通过蛋白和磷脂受体的结合，经过受体二聚、侧面迁移以及胞浆钙迁移，缀合物被置于激活的信号转导通道上(61)。运铁蛋白-多柔比星缀合物杀灭肿瘤细胞的一种机制是抑制了质膜氧化还原酶的活性，特别是NADH氧化酶的活性(62)。NADH氧化酶的抑制导致了细胞死亡(63)，多柔比星是这种酶的高效抑制剂(64，65)。运铁蛋白-多柔比星缀合物抑制NADH氧化酶的活性(66)，以及由NADH氧化所引发的下游反应，如通过钠-氢对向运输的电子丧失和质子交换(67)。运铁蛋白-多柔比星缀合物杀灭肿瘤细胞的第二种机制是运铁蛋白受体的分子控制。例如，微环境铁的螯合引发了肿瘤细胞凋亡，但是正常休眠细胞则本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备具有预定多柔比星／运铁蛋白比例的运铁蛋白－多柔比星缀合物的方法，其包括步骤：ａ）将多柔比星加到戊二醛连接子材料中，使得一分子多柔比星连接一分子戊二醛；ｂ）将多柔比星／戊二醛复合体加到运铁蛋白中，使得所得缀合物具有预定 的多柔比星／运铁蛋白比例，其中所述运铁蛋白－多柔比星缀合物基本不含二聚体、三聚体或聚集体。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：W佩奇福克，
申请(专利权)人：福克医药公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]