蜂毒肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种抗菌／抗内毒素的氨基酸类型的小分子多肽－蜂毒肽，结构式为ＩＮＬＫＡＩＡＡＬＡＫＫＬＬ－ＮＨ↓［２］。本发明专利技术可应用于制备杀灭细菌的药物和治疗脓毒症的药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及氨基酸类型的小分子多肽及其应用，更具体地说是一种蜂毒肽以及在用于制备通过杀菌、中和内毒素(lipopolysaccharide，LPS)和抑制呼吸爆发达到治疗脓毒症药物中的应用。
技术介绍
脓毒症是导致临床危重病人死亡的主要原因，特别是伴有严重LPS血症的革兰氏阴性(G-)杆菌的感染。G-菌菌血症的病死率为20～30％，而由菌血症发展而来的脓毒症休克其病死率可高达50～80％。目前针对脓毒症的治疗，临床上尚无有效措施，因此导致感染性疾病的治疗更为棘手，研究其发病机理并寻找有效的治疗措施一直是临床医学关注的焦点。近年来，随着对脓毒症研究的深入，存在于G-杆菌外膜上LPS的作用日益受到重视。LPS被认为是脓毒症休克病人死亡原因—失控性炎症反应综合征(systemicinflammatory response syndrome，SIRS)和代偿性抗炎症综合征(compensatoryanti-inflammatory response syndrome，CARS)的主要启动子。进入血中的LPS其主要生物学作用包括以下几个方面(1)与巨噬细胞接触后能诱生、释放多种炎症介质如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、自细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)等，通过这些介质直接或间接发挥局部及全身效应。(2)可与多种组织、实质细胞结合直接导致细胞损伤。(3)激活凝血、纤溶、补体系统，诱发DIC。(4)作用于α受体，促使肾上腺儿茶酚胺分泌，导致微循环障碍、血浆外渗，直至发生休克以及其它如发热、白细胞减少，Shwartzman反应等。在复杂的炎症反应网络中，分别针对TNF、IL-1等各种炎症因子的调控措施也不断提出，但结果令人失望。其主要原因在于各种不同的炎症因子相互作用密不可分，仅针对某个或数个细胞因子并不能解决问题。因此抓住矛盾的主要方面——LPS，寻找解决问题的突破点意义重大。国内外有关LPS的研究发现LPS存在于G-杆菌的细胞膜上，化学成分为脂多糖，其基本构成为O-特异性多糖链、核心多糖、类脂A三部分。其中类脂A是LPS的活性中心。LPS主要生物学作用为刺激单核-吞噬细胞系统诱生、释放多种炎症介质如TNF-α、IL-1、IL-6等，通过这些介质启动炎症反应网络并直接或间接发挥局部及全身效应。尽管针对LPS的研究较多，但临床上尚无一种能够安全有效地用于治疗脓毒症的药物。因此，将重点放在中和LPS上从而达到降低感染死亡率的目的具有非常重要的意义。近十余年来，国际上脓毒症的防治研究，主要有抗LPS核心糖脂(Lipid A)的多抗、单抗、各种抗细胞因子抗体及受体拮抗剂，如抗TNF抗体，抗IL-1抗体、抗IL-6抗体以及NO拮抗剂等。在动物实验研究中，上述制剂对脓毒症所致的脏器损伤有一定的保护作用，但在临床试验中都因疗效不确切而未获美国FDA批准。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抗菌/抗内毒素的氨基酸类型的小分子多肽—蜂毒肽。本专利技术的另一目的在于提供蜂毒肽在用于制备杀菌、中和拮抗内毒素、抑制细胞呼吸爆发达到治疗脓毒症的药物中的应用。蜂毒肽是一类来源于昆虫的由十余个氨基酸组成的小分子多肽，经过研究得知蜂毒肽具有广泛的生物学活性，如激活G蛋白和改变细胞内外Ca2+的分布，具有扩血管、促进胰岛素分泌和促肾上腺皮质激素的释放等功能。但在失控性炎症反应和脓毒症中，蜂毒肽对炎症反应细胞呼吸爆发有无影响及其在炎症反应中的作用，却知之甚少。本专利技术人根据LPS是一阴离子，其生物学活性的发挥依赖于其二糖骨架上带负电荷的阴离子基团与其受体中带正电荷的氨基酸残基的结合而实现，以及LPS的抑制剂多粘菌素B(PMB)、杀菌性/通透性增加蛋白、鲎抗内毒素因子等均为阳离子的特点，对天然蜂毒肽氨基酸序列进行改进，期望能筛选出拮抗脓毒症的新型多肽，以达到上述专利技术目的。通过目前具有杀菌活性的天然蜂毒肽，对其氨基酸序列进行分析，发现第11、12位氨基酸为赖氨酸的多肽其杀菌活性较强，通过改变其它位置的氨基酸合成多条多肽，进一步通过生物传感器和动物实验，筛选出与LPS的结合作用最强，其抗脓毒症模型小鼠效果最好的蜂毒肽。为了实现上述目的，本专利技术提供的蜂毒肽，类型为氨基酸；分子类型为肽；分子的序列由氨基酸的一字简码组成，表示如下INLKAIAALAKKLL-NH2。Merrifield创建的固相多肽化学合成方法(Merrifield RB.1963 J Am ChemSoc.852149)已发展成为一种成熟的众所周知的固相多肽化学合成技术。应用该技术，本专利技术采用Merrifield创建的固相多肽化学合成方法，通过Fmoc保护的氨基酸方法或Tboc保护的氨基酸方法人工合成或通过自动多肽合成仪进行合成，得到一系列的抗菌/抗内毒素蜂毒肽。得到的多肽经过高压液相(HPLC)纯化，并经生物活性鉴定。再通过初步的拮抗脓毒症动物试验，最后筛选出效果最好的本专利技术所述的蜂毒肽。本专利技术通过测定上述蜂毒肽的体外杀菌活性、体外结合、中和LPS和抑制LPS诱导的小鼠腹腔巨噬细胞TNF-α和IL-6产生的活性、体外抑制LPS刺激的巨噬细胞呼吸爆发的活性、所述蜂毒肽对大肠杆菌ATCC25922/LPS攻击小鼠的死亡保护作用以及所述蜂毒肽对脓毒症模型大鼠脏器的改善情况等一系列试验表明本专利技术所述的蜂毒肽对细菌/PS攻击造成的脓毒症模型动物具有保护作用，具体表现在①所述蜂毒肽对大肠杆菌ATCC25922等细菌具有一定的杀菌活性；②所述蜂毒肽具有一定的结合、中和LPS的活性，可抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞TLR4、TNF-a和IL-6mRNA的表达；③所述蜂毒肽抑制LPS刺激的小鼠腹腔巨噬细胞的呼吸爆发。故本专利技术所述的蜂毒肽可用于制备抗细菌药物。本专利技术所述的蜂毒肽可用于制备抗大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌和奇异变形杆菌感染药物。本专利技术所述蜂毒肽可用于制备内毒素所致疾病中对内毒素进行中和拮抗的药物。本专利技术所述蜂毒肽可用于制备内毒素所致疾病中抑制细胞呼吸爆发的药物。本专利技术所述蜂毒肽可用于制备治疗脓毒症的药物。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术及其效果作进一步说明图1蜂毒肽(3mg/kg)对细菌和LPS(20mg/kg)攻击小鼠的保护作用图2蜂毒肽与LPS结合的亲和力测定图3PMB与LPS结合的亲和力测定图4蜂毒肽和PMB中和LPS的活性比较图5蜂毒肽对LPS刺激腹腔巨噬细胞TLR4 mRNA表达的抑制图6蜂毒肽对LPS刺激腹腔巨噬细胞TNF-αmRNA表达的抑制图7蜂毒肽对LPS刺激腹腔巨噬细胞IL-6mRNA表达的抑制图8肝的病理切片，其中8-1为LPS对照组，8-2为蜂毒肽/LPS处理组图9肠粘膜的病理切片，其中9-1为LPS对照组，9-2为蜂毒肽/LPS处理组图10肺的病理切片，其中10-1为LPS对照组，10-2为蜂毒肽/LPS处理组图11肾的病理切片，其中11-1为LPS对照组，11-2为蜂毒肽/LPS处理组。在图5中MMarker；1阴性对照；2阳性对照；3LPS+蜂毒肽(10μmol/L)；4LPS+蜂毒肽(20μmol/L)；5LPS+蜂毒肽(40μmol/L)在图6中MMarker；1阴性对照；2阳性本文档来自技高网...

【技术保护点】
蜂毒肽，类型为氨基酸；分子类型为肽；分子的序列由氨基酸的一字简码组成，表示如下：ＩＮＬＫＡＩＡＡＬＡＫＫＬＬ－ＮＨ↓［２］。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郑江，郭毅斌，周红，吕根法，卫国，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]