中华蜜蜂蜂毒AcHA基因及其编码的多肽和制备方法技术

本发明专利技术公开了一种中华蜜蜂蜂毒ＡｃＨＡ基因序列及其编码的多肽和制备方法。该ｃＤＮＡ序列编码的蛋白是意大利蜜蜂蜂毒ＡｍＨＡ的一个同系物，它与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３中从核苷酸１－１１６４位的核苷酸序列有至少７０％的同源性。所述序列编码－具有ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．４所示的序列的多肽。此外，还提出了含中华蜜蜂蜂毒ＡｃＨＡ基因的载体、宿主细胞，与中华蜜蜂蜂毒ＡｃＨＡ基因相关的抗体，具有蛋白活性中华蜜蜂蜂毒ＡｃＨＡ的多肽、相关抗体的制备方法。本发明专利技术为进一步研究ＡｃＨＡ相关的酶活分子机理，开发与ＡｃＨＡ相关的生物医药、诊断试剂及生物试剂打下了基础。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及。
技术介绍
意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒透明质酸酶(Bee venomous hyaluronidase，BvHA)是意大利蜜蜂蜂毒的二个主要过敏原之一，约占蜂毒干重的2％-3％(Science 1972，177314-322)按来源和生化性质，它属糖蛋白，是一种催化透明质酸长链中N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)与D-葡糖醛酸(GlcA)间β-1，4糖苷键水解，产生4糖产物GlcA-GlcNAc-GlcA-GlcNAc的一种β-N-乙酰-D-氨基己糖苷酶(β-N-acetyl-D-hexosaminidase)，或称透明质酸氨基己糖苷酶(Hyaluronoglucosaminidase)。BvHya具有很强的生物活性，使蜂毒在局部组织间渗透和扩散(Structure.2000，81025-1035)。1993年，Gmachl等人应用生物技术方法，利用意大利蜜蜂蜂毒腺总RNA反转录成cDNA，通过噬菌体构建cDNA文库，并根据该蜂蜂毒透明质酸酶N端氨基序列合成简并核苷酸序列作为引物，以意蜂基因组DNA为模板进行PCR反应，扩增出一段47bp的上游序列。然后以此序列作为探针作文库筛选，获得了3个阳性克隆，其中两个克隆插入片段为1.45kb，一个克隆插入片段为1.25kb。根据前两个克隆插入片段的测序结果，该cDNA所编码的HA成熟肽为349个氨基酸残基。后一个克隆插入片段中，除起始端198bp及第199-416位为内含子外，其余为前两个克隆中的编码序列(Insect Biochem.1988，18511-514)。它们的cDNA被命名为AmH。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种中华蜜蜂蜂毒AcHA的多核苷酸，该多核苷酸编码意大利蜜蜂蜂毒AmHA蛋白的一个同系物。本专利技术目的之二是提供一种由中华蜜蜂蜂毒AcHA多核苷酸编码的中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白。本专利技术目的还提供了这种制备中华蜜蜂蜂毒AcHA核苷酸探针、含中华蜜蜂蜂毒AcHA核苷酸的重组载体、含重组载体的宿主细胞，以及多肽抗体的方法。在本专利技术，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸序列有至少70％同源性，或者所述的核苷酸序列能在中度严条件下与SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸杂交，较佳地，该多肽具有SEQ ID No.4所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸序列。在本专利技术还提供了一种分离的中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白多肽，它包括具有SEQ ID No.4氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.4序列的多肽。本专利技术还提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA；一种所述载体转化的宿主细胞。本专利技术还提供了一种制备具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成中华蜜蜂蜂毒AcHA表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.3核苷酸1-1164位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白的重组细胞；(c)在适合表达中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽。本专利技术发现了一种编码中华蜜蜂蜂毒AcHA的基因，该基因所编码的AcHA(中华蜜蜂蜂毒透明质酸酶)是一种生物活性物质，可应用于医学上心血官疾病、肿瘤等疾病的治疗，可作为药物的透皮因子用于药物制剂，可作为抗原用于蜂毒免疫制剂、蜂毒过敏诊断试剂的制备，可作为生物学研究的工具酶。中华蜜蜂AcHA基因可为研究中华蜜蜂蜂毒过敏的分子机理，为开发利用中华蜜蜂蜂毒资源提供新的依据。具体实施例方式在本专利技术的一个具体实施方案中，本专利技术的分离的多核苷酸全长为1164个核苷酸，其详细序列见SEQ ID No.3，开放读框位于1-1164位核苷酸。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，术语“中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.3中1-1164位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQ ID No.3序列的编码框1-1164位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.3中1-1164位核苷酸序列同源性低至约70％简并序列也能编码出SEQ ID No.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No.3中从核苷酸1-1164位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与中华蜜蜂蜂毒AcHA相同功能的蛋白的、SEQID No.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。在本专利技术中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层折、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。在本专利技术中，术语“中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白多肽”指具有中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白活性的SEQ ID No.4序列的多肽。该术语还包括具有与中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白相同功能的、SEQ ID No.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括中华蜜蜂蜂毒AcHA蛋白的活性片段和活性衍生物。该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体，诱导突变体，在高或低的严谨度条件下能与中华蜜蜂蜂毒AcHA DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本专利技术还提供了其他多肽，如包含中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本专利技术还包括了中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽的可溶性片段。通常，该片段具有中华蜜蜂蜂毒AcHA多肽编码序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：编码具有中华蜜蜂蜂毒ＡｃＨＡ活性多肽的核苷酸序列。所述的核苷酸序列与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３中从核苷酸１－１１６４位的核苷酸序列有至少７０％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与ＳＥ Ｑ ＩＤ Ｎｏ．３中从核苷酸１－１１６４的核苷酸序列杂交。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：沈立荣，和传溪，程家安，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]