中华蜜蜂大胡蜂溶血肽前体基因及编码的多肽和制备方法技术

本发明专利技术公开了一种中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前体基因的编码序列及其编码的多肽和制备方法。该ｃＤＮＡ序列编码的蛋白是意大利蜜蜂蜂毒溶血肽前体的一个同系物，它与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５中从核苷酸１－２１３位的核苷酸序列有至少７０％的同源性。所述序列编码－具有ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６所示的序列的多肽。此外，还提出了含中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前体和溶血肽前体基因末端的１３０－２１３核苷酸序列的载体、宿主细胞，与中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽相关的抗体，具有蛋白活性中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽的多肽、相关抗体的制备方法。本发明专利技术为进一步研究中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽的分子作用机理，开发与溶血肽相关的生物医药、诊断试剂、生化试剂以及生物杀虫剂打下了基础。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前体(Prepromelittin)基因及其编码的多肽和制备方法。
技术介绍
意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒溶血肽(Melittin)是意大利蜜蜂蜂毒的基本组成成分，约占蜂毒的40％～50％(Vol.3.New YorkAcademic，1971，535)，按来源和生化性质，它是一种活性多肽，其中90％的溶血肽以游离状态存在，而另外的10％则以Melittin N1-甲酰化形式存在(Biochem.Biophys.Res.Commun.，1967，27275-280)。它具有非常重要的生物学活性，能引起红细胞溶解(Z.Physiol.Chem.，1970，351，884)、脂质体释放标记离子(marker ions)(J.Biol.Chem.，1969，244，3575)以及肥大细胞释放组胺(J.Pharmacol，1965，25，29)等等。Melittin合成时有两种前体存在。一种是Promelittin，在蜜蜂毒腺或注入蜂王毒腺提取物的蛙卵中发现。在蛙卵中合成时，Promelittin是稳定的终产物，而在毒腺中，它将缓慢地转变为Melittin；第二种称为Prepromelittin，分子量比Promelittin大，只能在无细胞体系中转录的MelittinmRNA上发现(Proc.Natl.Acad.Sct.USA，1978，75，701-704)。1983年，Vlasak等利用意大利蜜蜂蜂王毒腺总RNA反转录成cDNA，然后将合成的双链cDNA克隆到pBR322载体中，构建cDNA文库，用探针筛选出带有大于200bp插入片段的阳性克隆，然后再将它们亚克隆到PUC8载体中，再经酶切鉴定从中筛选出2个阳性克隆，对其中含有最大插入片段的PUM13/4进行测序，结果显示该插入序列为Prepromelittin的核苷酸序列，该cDNA所编码的成熟肽--蜂毒溶血肽前体蛋白为49个氨基酸残基(Eur.J.Biochem.，1983，135123-126)。Prepromelittin蛋白实质上是蜂毒溶血肽的天然融合蛋白，它在蜜蜂毒腺细胞中合成后经二肽蛋白酶水解成蜂毒Melittin。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的多核苷酸，该多核苷酸编码意大利蜜蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的一个同系物。本专利技术目的之二是提供一种由中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin多核苷酸编码的最终产物--中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Melittin蛋白。本专利技术目的还提供了这种制备中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸探针、含中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin核苷酸和Prepromelittin基因末端的130-213核苷酸序列(即Melittin这一部分的核苷酸序列)的重组载体、含重组载体的宿主细胞，以及多肽抗体的方法。在本专利技术，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70％同源性，或者所述的核苷酸序列能在中度严格条件下与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸杂交，较佳地，该多肽具有SEQ ID No.6所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列。在本专利技术还提供了一种分离的中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的最终表达产物--Melittin蛋白活性多肽，它包括具有SEQ ID No.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.6序列的多肽。本专利技术还提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA；一种所述载体转化的宿主细胞。本专利技术还提供了一种制备具有中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的最终表达产物--Melittin蛋白的活性多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的多肽的核苷酸序列和编码具有Prepromelittin基因末端的130～213核苷酸序列(即Melittin这一部分的核苷酸序列)可操作地连于表达调控序列，形成中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin和Melittin的表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5核苷酸1-213位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin和Melittin的重组细胞；(c)在适合表达中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin和Melittin的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Melittin蛋白活性的多肽。本专利技术发现了一种编码中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin的基因，该基因所编码的Prepromelittin是蜂毒Melittin的天然融合蛋白，而蜂毒Melittin则是一种生物活性肽，可应用于医学上心血官疾病、肿瘤等疾病的治疗，可作为抗原用于蜂毒免疫制剂、蜂毒过敏诊断试剂的制备，可作为一种天然抗微生物肽用于植物病、虫害的防治，也可作为一种模型肽用于膜作用机制、钙调蛋白作用机理等方面的研究。中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin基因可为研究中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒中与Melittin相关的分子作用机理，为开发利用中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒资源提供新的依据。具体实施例方式在本专利技术的一个具体实施方案中，本专利技术的分离的多核苷酸全长为213个核苷酸，其详细序列见SEQ ID No.5，开放读框位于1-213位核苷酸。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，术语“中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin蛋白的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID No.5中1-213位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQ ID No.5序列的编码框1-213位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.5中1-213位核苷酸序列同源性低至约70％。简并序列也能编码出SEQ ID No.6所述的序列。该术语还包括能在中度严格条件下，更佳地在高度严格条件下，与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No.5中从核苷酸1-213位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒Prepromelittin相同功能的蛋白的SEQ ID No.6序列的变异形式。这些变异形本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：编码具有中华蜜蜂、大胡蜂蜂毒溶血肽前体多肽的核苷酸序列；所述的核苷酸序列与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５中从核苷酸１－２１３位的核苷酸序列有至少７０％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严格条件下与 ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５中从核苷酸１－２１３的核苷酸序列杂交。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：施婉君，张传溪，张素方，程家安，沈立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]