亚非马蜂镇静肽前体基因及其编码的多肽和制备方法技术

本发明专利技术公开了一种亚非马蜂蜂毒镇静肽前体（Ｐｒｅｐｒｏｓｅｃａｐｉｎ）基因序列及其编码的多肽和该基因经过翻译后加工产物镇静肽（Ｓｅｃａｐｉｎ）的制备方法。该ｃＤＮＡ序列编码的蛋白是意大利蜜蜂蜂毒Ｐｒｅｐｒｏｓｅｃａｐｉｎ的一个同系物，它与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５中从核苷酸１～２３４位的核苷酸序列有至少７０％的同源性。所述序列编码－具有ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．６所示序列的多肽。此外，还提出了含亚非马蜂蜂毒Ｐｒｅｐｒｏｓｅｃａｐｉｎ基因的载体、宿主细胞，与亚非马蜂蜂毒Ｐｒｅｐｒｏｓｅｃａｐｉｎ基因相关的抗体，具有蛋白活性亚非马蜂蜂毒Ｓｅｃａｐｉｎ的多肽、相关抗体的制备方法。本发明专利技术为进一步研究Ｓｅｃａｐｉｎ相关的多肽活性分子机理，开发与Ｓｅｃａｐｉｎ相关的生物医药、诊断试剂及生物试剂打下了基础。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种新的蜂毒基因核苷酸序列。更具体地说，本专利技术涉及亚非马蜂蜂毒镇静肽前体(Preprosecapin)基因的cDNA序列，该cDNA序列编码的多肽是意大利蜜蜂Preprosecapin蛋白的同系物，该多肽经过翻译后加工所得到的多肽(成熟肽)是意大利蜜蜂镇静肽(Secapin)的同系物。本专利技术还涉及有该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的制备方法。
技术介绍
意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒镇静肽(Bee venomous Secapin)是意大利蜜蜂蜂毒的四个多肽之一，约占蜂毒干重的1％，由25个氨基酸组成(Eur.J.Biochem.1978，83405-410；Abstr.15 Eur.Pepetide.Symp.1978，p84)。按来源和生化性质，它属碱性多肽，Secapin其生物活性与溶血肽相似，具有消炎、抗菌、降压、镇静等作用(Eur.J.Biochem.1978，83405-410)。1984，Vlask和Kreil将意蜂蜂王毒腺cDNA插入pBR322的pstI和Cla I位点，用32P标记的cDNA探针筛选出阳性克隆(PUM9/24，PBMC1)，酶切后再亚隆到PUC8，得到了蜂毒Preprosecapin基因，对该基因的测序结果进行氨基酸序列推导，获77个氨基酸残基，其中最后25个氨基酸残基与已知Secapin氨基酸序列一致，前32个氨基酸残基为信号肽，中间20个氨基酸为极性肽前体，Preprosecapin基因经过翻译后加工，即在蜜蜂的毒囊中经过蜜蜂体内一种水解酶的裂解便得到了活性多肽Secapin(Eur.J.Biochem.1984，145279～242.)。Secapin与其他几种蜂毒多肽在医学与生物物理学上有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因的多核苷酸，该多核苷酸编码意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的一个同系物，该前体蛋白经加工后得到的活性多肽为意大利蜜蜂Secapin多肽的一个同系物。本专利技术目的之二是提供一种新的意大利蜜蜂Preprosecapin蛋白的同系物，该多肽为亚非马蜂Preprosecapin蛋白。本专利技术目的还提供了这种制备亚非马蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸探针、含亚非马蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸的重组载体、含重组载体的宿主细胞，以及多肽抗体的方法。在本专利技术，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％同源性，或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸杂交，较佳地，该多肽具有SEQ ID No.6所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列。在本专利技术还提供了一种分离的亚非马蜂蜂毒Secapin蛋白活性多肽，它包括具有SEQ ID No.6中53～77氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.6中53～77氨基酸序列的多肽。本专利技术还提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA；一种所述载体转化的宿主细胞。本专利技术还提供了一种制备具有亚非马蜂蜂毒Secapin活性多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有亚非马蜂蜂毒Preprosecapin基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成亚非马蜂蜂毒Preprosecapin表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的重组细胞；(c)在适合表达亚非马蜂蜂毒Preproecapin蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有亚非马蜂蜂毒Secapin蛋白活性的多肽。本专利技术发现了一种编码亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白基因，该基因所编码的Preprosecapin多肽(亚非马蜂蜂毒镇静肽前体)经过胡蜂体内一种水解酶的裂解便得到了活性多肽Secapin，此活性多肽是一种生物活性物质，可应用于医学上的关节炎、神经性疾病、吸毒等的辅助治疗，可作为抗原用于蜂毒免疫制剂的制备，可作为生物学研究的工具酶。亚非马蜂Preprosecapin基因可为研究亚非马蜂蜂毒免疫的分子机理，为开发利用亚非马蜂蜂毒资源提供新的依据。具体实施例方式在本专利技术的一个具体实施方案中，本专利技术的分离的多核苷酸全长为234个核苷酸，其详细序列见SEQ ID No.5，开放读框位于1～234位核苷酸。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，术语“亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白(或多肽)的核苷酸序列，如SEQ IDNo.5中1～234位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQ ID No.5序列的编码框1～234位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.5中1～234位核苷酸序列同源性低至约70％简并序列也能编码出SEQ ID No.6所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与亚非马蜂蜂毒Preprosecapin相同功能的蛋白的、SEQ ID No.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。在本专利技术中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层折、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。在本专利技术中，术语“亚非马蜂蜂毒Secapin蛋白多肽”指具有亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白活性的SEQ ID No.6序列53-77的多肽。该术语还包括具有与亚非马蜂蜂毒Preprosecapin蛋白相同功能的、SEQ ID No.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：编码具有亚非马蜂蜂毒镇静肽前体蛋白的核苷酸序列；所述的核苷酸序列与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５中从核苷酸１～２３４位的核苷酸序列有至少７０％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．５中从核苷酸１～２３４的核苷酸序列杂交。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张素方，张传溪，施婉君，程家安，沈立荣，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]