本发明专利技术的膜支架蛋白（ＭＳＰ）与疏水或部分疏水性蛋白质装配所形成的可溶性纳米级颗粒保留了其天然结构和功能；就稳定性及生物活性和天然构象保存而言，它们优于脂质体和去污剂微团。当存在磷脂时，ＭＳＰ可形成纳米级磷脂双层圆盘，通式ＭＳＰ稳定了该颗粒的双层结构域周缘。这种颗粒性双层结构可经操作在液体或固体支持物中掺入蛋白质，包括与这种表面敏感技术一起用作扫描探针显微术或表面胞质基因组共振术。就掺入蛋白质的完整性和保持其生物化学活性而言，这种纳米级粒子是坚固的，可促进药物和生物研究、结构／功能相关性、结构确定、生物分离和药物开发。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
技术介绍
本专利技术的领域包括分子生物学和膜技术。具体地讲，本专利技术涉及膜支架蛋白质(MSP)，尤其是人造MSP，并涉及利用这些膜支架蛋白稳定、分散和溶解完全或部分疏水性蛋白质(包括但不限于外周、包埋或整合膜蛋白)同时保留这些蛋白质的生物学活性，或稳定、分散和溶解纯化的和用化学方法溶解或直接溶解膜片段或膜以使其模拟天然膜环境的方法。所述疏水性蛋白质与膜支架蛋白相结合形成本文称为纳米圆盘(nanodisc)的纳米级圆盘状结构。若干年前，我们通过扫描探针显微术，例如将合成的高密度脂蛋白圆盘(rHDL，apo A-I)定向吸附在云母上，研究了与能载脂蛋白(从人血浆制备)复合的脂质的结构和功能并分析了这些分子装配体的特性(Carlson等，1997；Bayburt等，1998；Bayburt等，2000；Carlson等，2000)。所观察到的圆盘结构直径约10nm，高约5.5nm。拓扑学观察到5.5nm的高度与外延朝向平坦的云母原子表面上的单一双层膜非常相容(Carlson等，1997)。我们随后发现，可将纯化的膜蛋白重建到某些这种圆盘结构的磷脂双层结构域之中，并利用定向蛋白质-双层装配体的表面结构或分光光谱技术监测研究了圆盘在溶液中或随后吸附于合适的表面上的情况。在后一种情况下，含有膜蛋白的圆盘结构易于识别并能提供判断样品和图象质量的参考点。高密度脂蛋白(HDL)是一种称为apo A-I的蛋白质成分与各种磷脂的球形装配体。HDL颗粒作为胆固醇逆向转运的主要通路在哺乳动物胆固醇稳态中起着重要作用(Fielding和Fielding，1991)。HDL作为胆固醇转运体的功能依赖于与HDL结合的酶卵磷脂-胆固醇酰基转移酶或LCAT(Glomset，1968；Jonas，1991)的活性，LCAT能介导胆固醇酯插入HDL脂蛋白颗粒中。apo A-I蛋白的某些部分是这种酶活性所必需的(Holvoet等，1995)。此外，据认为apo A-I蛋白的N-末端球状结构域中的一部分负责与细胞表面受体相互反应。根据对染色标本的电镜观察，HDL颗粒的新生形式呈圆盘状(Forte等，1971)。我们的实验室在水环境条件下对rHDL的合成形式进行了原子力显微术(AFM)研究，证实了这一结果。然而，这种形式不是其在体内循环中的主要形式。而且，从apo A-I的序列看来涉及稳定更常见的球状结构形式。已提出HDL圆盘新生结构的两种通用模型。一种模型是apo A-I蛋白围绕环状双层部分形成由弯曲的分节α螺旋棒构成的水平环带或“带状”(Wlodawer等，1979)。另一种模型，该蛋白质以一系列α螺旋区段垂直跨于该双层两边缘间(Boguski等，1986)。这两种模型主要以间接的实验证据为基础，尚没有得到可区分它们的整体颗粒的三维结构。目前已接受的模型是环带模型，该模型与一些电镜观察和中子散射数据相符(Wlodawer等，1979)，其中的螺旋像“带子”一样纵向排列围绕在双层圆盘的周边(Segrest等，1999)。与早期的研究相反，最近用新的样品定向法作圆二色性测量的红外光谱研究与该环带模型更加相符(Wald等，1990；Koppaka等，1999)。迄今为止，还没有完整的直接证据可以证明这一模型是正确的，虽然已得到了不含脂质的apoA-I晶体的低分辨率X-射线晶体结构(Borhani等，1997)。N-末端载短的apo A-I的低分辨率晶体结构显示一个单元含有由四个螺旋棒构成的四聚物，四个螺旋棒弯曲成马蹄状并联合产生一大约125×80×40的圆形聚集体。提示这种弯曲构象的二聚物能够形成圆盘状颗粒。迄今收集到的与胆固醇逆向转运循环和HDL颗粒成熟有关的信息，提示apo A-I蛋白有独特的性质，使它能自发地与膜相互反应导致脂蛋白颗粒的形成。已有人提出了最初的apo A-I脂质结合反应(Rogers等，1998)，但双层结构形式如何转变成圆盘状颗粒的机理仍不清楚。现有证据表明，稳定不含脂apo A-I的能量非常低，不能维持两种构象之间的平衡(Atkinson和Small，1986；Rogers等，1998)。一种构象可能是长螺旋棒，另一种可能是约一半长的螺旋性“发夹”结构。已知当apo A-I遇到脂质膜时，稳定能量低和构象可变使其可被结构性识别，这促进了膜和蛋白质中发生结构变化，从而产生不连续的脂蛋白颗粒(Rogers等，1998)。一旦这些颗粒形成，apo A-I仍可能经历特定的构象变化，从而影响到脂蛋白颗粒的动力学功能和与酶及受体的相互反应。所有这些相互反应和变化都发生在蛋白-脂质介面上并有特定的拓扑学构象，使关键残基暴露于表面。因此，几乎没有理由相信apo A-I自身可理想的产生稳定的、纳米级大小的可控尺寸的磷脂双层结构。已采用不同类型的脂质聚集体来重建和研究纯化的膜蛋白；这些脂质聚集体包括膜分散体、去污剂微团和脂质体(附图说明图1)。供生化和物理研究的纯化系统需要稳定性，但这不是这些系统所固有的，也不限于这些系统。脂质体是内部含水的封闭的球形双层外壳。通过去污剂透析或其它方法重建脂质体时通常会导致蛋白质朝外和朝腔内空间的随机取向。由于靶配体或蛋白质通常亲水或带电荷，如图1所示，因而它们不能通过脂质体双层，尽管在一些情况下这是有利的。由于脂质双层的两侧不与大部分溶剂接触，难于研究双层相对侧区域之间的耦合效果。脂质体亦倾向于聚集和融合，且在长时间内或在某些物理操作下(如停止流动或剧烈混合时)通常不稳定。通过孔径限定的圆柱形孔挤出而得到的脂质体的大小显示不均一的直径，在粒径分布上具有多重分散性。由于光散射、双层中膜蛋白的聚集以及热力学不稳定，脂质体可能难以维持(Angrand等，1997；Savelli等，2000)。脂质体的表面积较大(105-1082)。为得到掺入单一膜蛋白的脂质体，需要较大的脂质蛋白质摩尔比。去污剂微团通过与蛋白质的膜-包埋部分相互反应使膜蛋白溶解并易于使用。去污剂微团是动态变化并经历结构波动，这促进了亚单位的解离并经常在处理蛋白质稀释液时发生困难。然而，过量的去污剂微团对于维持蛋白质处于非聚集和溶解状态是必需的。去污剂还可能引起变性并常常不能保持磷脂双层系统的性能。支持和调节蛋白质结构和功能常常需要特定种类的磷脂(Tocanne等，1994)。因此，去污剂溶解的膜蛋白质的结构、功能和稳定性可能产生问题。由于需要过量的去污剂微团，蛋白质复合物可能解离，这取决于蛋白质浓度和去污剂和蛋白质的比例。相反，本专利技术的MSP纳米结构在结构上更加坚固，与单室脂质体相比，它含有大小和组分不连续的磷脂双层模拟结构域以及较高的稳定性和较小的表面积。圆盘状结构象去污剂那样使得能够接触双层的两侧，并提供了像脂质体那样的双层结构。此领域对能分散膜蛋白和其它疏水或部分疏水性蛋白质，从而保存那些蛋白质的天然活性和性质的稳定而明确的组合物有长期的需要。蛋白质以外的化合物也可分散在本专利技术的纳米级颗粒中。专利技术概述本文所用的膜支架蛋白(MSP)是一种人造两性蛋白质，它能与磷脂以及磷脂混合物自身组装成纳米级膜双层。这些纳米级装配体的一个亚类是圆盘状的，称为纳米圆盘结构。这些纳米级颗粒的直径可以是约5-500nm，约5-100nm或约5-20nm。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种在水溶液中装配成颗粒的人造膜支架蛋白，所述人造膜支架蛋白包含至少一个两性螺旋。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：SG斯莱加尔，TH贝伯特，MA舒勒，NR西维简，YV格里尼科瓦，IG杰尼索夫，SJ格里梅，
申请(专利权)人：伊利诺斯州立大学托管会，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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