灵芝甾醇类提取物及其制备方法与应用技术

灵芝甾醇类提取物，其特征在于，其由灵芝提取而获得，其主要成分为白色片状结晶２４－甲基－胆甾－５，２２－二烯－３β醇，分子式Ｃ↓［２８］Ｈ↓［４６］Ｏ，其化学结构式如下：　　　　　＊＊＊。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种含有机有效成份的医药配制品，特别涉及一种灵芝甾醇(Sterols)类提取物及其制备方法与应用。
技术介绍
灵芝具有较强的药用价值，传统的服用方法为煎服或煮食，被提取的活性药物成份较少，一般只有多糖成份被提取，即药物活性物质的利用率低。现有技术中也有从灵芝中分离提取药物有效成份的作法，例如中国专利93101870.6(授权公告日1995年5月17日)就公开了一种复方灵芝营养液及其制备方法，但该专利技术只是将灵芝的粗提液作为一种组分与何首乌及绞股兰的有效萃取物组合而成为一种药物，用于提高免疫力及延缓衰老，该专利技术并未对灵芝的该提取成份及药理药效作进一步的深入研究。从灵芝中分离提取得到的甾醇有近20余种，其中因骨架不同而分为麦角甾醇和胆甾醇两种类型，检索发现未见从灵芝中分离提取而获得的甾醇类提取物的药理活性报道及将其应用于临床。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种从灵芝中精确提取而获得的活性物质灵芝甾醇类提取物；提供该提取物的制备方法；及该提取物在制备具有抗各种病因引起的脑缺血作用的药物中的应用。本专利技术的目的可经如下方案实现。灵芝甾醇类提取物，其要点在于，其由灵芝提取而获得，其主要成分为白色片状结晶，其名称为24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇，分子式C28H46O，其化学结构式如下 这种从灵芝中提取而获得的物质为一种甾醇类化合物，本化合物存在28个碳，其中6个CH38个CH2，11个CH，以及3个季碳。利用一维(1H、13C、DEPT)和二维核磁共振技术对化合物进行了结构鉴定，确定其结构为24-甲基-胆甾-5，22-二烯-3β醇。采用该灵芝甾醇类提取物对大鼠的脑皮层神经元缺氧再氧化损伤(简称H/R)进行治疗，具体为采用体外原代培养SD大鼠大脑皮层细胞，通过缺氧(12h)再氧化(24h)损伤建立脑缺血再灌注体外模型，观察发现灵芝甾醇类提取物(用量组0.01；0.1；1ug/ml)对受损细胞均有明显保护作用。用PI和Hoechst33258双标的方法鉴定神经元的生命状态，在激光共聚焦显微镜下观察标记情况。PI和Hoechst33258双染的细胞为死细胞，Hoechst33258单染为活细胞。结果可见H/R模型组细胞中PI和Hoechst33258双染的死细胞明显增多，而应用灵芝甾醇类提取物后可明显增加活细胞的比例(详见图1)。应用MTT法测定细胞的存活率和细胞代谢情况。结果H/R使神经元的存活率明显下降，而灵芝甾醇类提取物对受损细胞有显著的保护作用。应用荧光探针DCF-DA特异性标记细胞内自由基，在激光共聚焦显微镜下测定细胞内自由基含量。可见H/R可显著诱导自由基的产生，镜下可见荧光探针强度明显增强，灵芝甾醇类提取物治疗组荧光强度则明显降低，也就是灵芝甾醇类提取物可显著抑制细胞内增高的自由基水平。以裂解液制备细胞裂解物，用bradford方法鉴定蛋白含量。应用南京建成生物工程研究所生产试剂盒，比色法测定脂质过氧化产物戊二醛(MDA)水平。结果可见，灵芝甾醇类提取物也可降低受损神经元内异常升高的MDA，说明抗氧化作用可能是灵芝甾醇类提取物对神经细胞保护作用的机制之一。同时，应用南京建成生物工程研究所生产试剂盒，我们还检测了神经元内总超氧化物歧化酶(SOD)及Mn-SOD活性。我们发现灵芝甾醇类提取物可明显增加神经元内SOD及Mn-SOD活性，而对Cu-ZnSOD活性并没有明显作用，这证明Mn-SOD可能是灵芝甾醇类提取物发挥其抗氧化作用的关键酶，通过增加Mn-SOD的活性而增强神经细胞的抗氧化能力(详见图2)。用抗p65单克隆抗体标记细胞内核转录因子NF-κB，用免疫荧光的方法在激光共聚焦显微镜下对NF-κB进行定位观察。可见在正常情况下NF-κB基本定位于细胞浆内，而在缺氧12小时复氧45分钟时，NF-κB则大量向细胞核内转位，应用灵芝甾醇类提取物则明显拮抗了NF-κB的活化及核转位。制备细胞裂解液，用Western blot的方法检测NF-κB特异性抑制物I-κB的表达水平。特异性一抗应用浓度为1∶100，二抗应用浓度用1∶1000。实验发现H(12h)/R(45min)可增加I-κB的降解，而灵芝甾醇类提取物可抑制此变化。因此我们认为灵芝甾醇类提取物通过抑制I-κB的降解进而抑制了NF-κB的活化和核转位。制备细胞裂解液，并应用ELISA试剂盒，按照试剂盒说明方法检测炎性细胞因子TNFα和IL-1β在细胞内的表达水平，发现H/R可显著升高TNFα和IL-1β的水平，而灵芝甾醇类提取物可抑制此变化。因为NF-κB是多种细胞因子表达的关键调控因子，所以我们推测灵芝甾醇类提取物可能通过抑制NF-κB的活化而影响TNFα和IL-1β的表达，从而抑制了炎性细胞因子对神经元的免疫损伤。又因为有实验证明SOD可抑制NF-κB的活化，所以我们推测Mn-SOD可能是灵芝甾醇类提取物对H/R损伤细胞发挥保护作用的关键作用位点，进而从抗氧化和抗免疫两个机制对抗H/R损伤。医学上称脑缺氧是因为脑供血不足而引起的，因而本灵芝甾醇类提取物对大脑皮层神经元缺氧具有保护作用，故而同样对脑缺血具有保护作用。一系列的研究均表明，专利技术人从灵芝中提取的新的甾醇类提取物对治疗由各种病因引起的脑缺血(特别是对大脑皮层神经元缺氧)具有突出的有益效果，而且因其具有的准确的分子结构式使其治病作用机理较为明确，药理作用突出，药物活性物质的利用率高。灵芝甾醇类提取物，其要点在于，还包括次要成分白色结晶胆甾-5，7-二烯-3β醇，其化学结构式如下 该化合物同样是通过一维(1H、13C、DEPT)和二维核磁共振技术对提取物进行鉴定而获得。本专利技术的另一目的提供一种灵芝甾醇类提取物的制备方法，其要点在于，包括如下依序进行的步骤(1)提供一种灵芝作为原料母体；(2)破碎该原料母体而得破碎物；(3)用乙醇对破碎物进行回流提取4～10h、离心而得提取液；(4)将提取液浓缩至浓缩液中含生药量0.5～1.5g/ml，静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗提物；(5)将粗提物用热乙醇溶解，提取溶解液并静置10小时以上，温度4～5℃，收集粗结晶；(6)将粗结晶用乙醇稀碱溶液处理16～48小时，收集不溶物，(7)将不溶物用浓碱溶液碱化24h，过滤，收集滤液；(8)用等量乙醚对滤液进行萃取并收集乙醚层；(9)将乙醚层用水洗至中性，进行干燥，待乙醚挥发完全后所得固体物即为灵芝甾醇类提取物。对工艺步骤可作如下解释作为原料母体的灵芝可以是袋料栽培而获得的灵芝子实体，也可以是段木栽培的灵芝的子实体，甚至还可以是经微生物发酵而获得灵芝菌丝体。采用常用破碎装置对灵芝原料母体进行破碎，破碎后的灵芝状态可以为片状或烟丝状，只要满足可以获得细胞壁已被粉碎的母体即可。因为欲提取的灵芝甾醇类化合物溶于乙醇，所以采用乙醇对破碎物进行回流提取，并通过离心去渣而获得纯清的提取液。回流提取的时间越长，提取率越高，但耗时长，成本高，经验表明采用乙醇回流提取甾醇化合物的最佳时间为5～6小时。而乙醇与破碎物的重量比可为10∶1。对提取液进行浓缩获取药物活性成份浓度较高的浓缩液，同时也回收乙醇，因为乙醇易挥发，因而通常采用加热蒸发方式回收乙醇。浓缩液中含生药量的浓度会对接下来的纯化工本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林志彬，王赛贞，吕松涛，林树钱，赵洪波，
申请(专利权)人：福州绿谷生物药业技术研究所，林志彬，王赛贞，吕松涛，林树钱，赵洪波，
类型：发明
国别省市：