一种磷脂的精确定量分析方法技术

本发明专利技术公开了一种磷脂的精确定量分析方法，从每类磷脂均选择若干个磷脂标品配制成混合标准溶液，采用衍生试剂进行轻标记得到内标溶液；待测样品中的磷脂经提取后，采用相应的稳定同位素衍生试剂进行重标记后，平行定量加入内标溶液后进行质谱分析；以所选择的磷脂标品的衍生物质荷比为横坐标，以其摩尔数相同的条件下的相对丰度为纵坐标，建立每类磷脂的校准曲线；将待测样品中磷脂轻标记衍生物的质荷比M

A method for accurate quantitative analysis of phospholipids

The invention discloses a precise quantitative analysis method of phospholipids, phospholipid were selected from each of several standard phospholipids is formulated into a mixed standard solution, using a derivative reagent to remember to light standard internal standard solution; the sample of phospholipids extracted, hormone derivative reagent re labeled using stable isotope composition after the corresponding parallel quantitative mass spectrometry analysis, adding internal standard solution; in the selected standard phospholipid material derivative ratio as the abscissa and the relative abundance of the mole number under the same conditions as the ordinate, the establishment of calibration curves for each kind of phospholipids to be tested; M mass samples of phospholipids in light labeled derivatives

【技术实现步骤摘要】
一种磷脂的精确定量分析方法
本专利技术涉及一种磷脂的精确定量分析方法，属于分析检测领域。
技术介绍
磷脂是一类含有磷酸基团的脂质，是脂类化合物的重要组成部分，是构成细胞膜的重要成分，能够对所有生物体的细胞膜结构和功能产生重要影响，并在生物信号传导方面发挥重要作用。磷脂有促进脂类代谢和转运、保证血管通畅及正常肝脏功能的作用，磷脂代谢与许多不同疾病如心血管疾病等密切相关，是重要的信号分子。通过了解磷脂化合物在生物体内的代谢情况，结合磷脂化合物的主要生理功能，进而可对磷脂化合物在生命活动中的作用进行全面深入地研究。生物质谱技术是目前磷脂类化合物分析的核心工具。目前，鸟枪质谱技术可对脂质进行高灵敏度，高通量的定性分析，但此技术应用于复杂体系磷脂类化合物的定量分析，还存在许多问题。其中一个最主要的原因是进行磷脂分析时，分析的不是单独的某一个磷脂分子，而是复杂生物样品中数以百计的磷脂分子含量的变化。理论上，通过质谱定量任一化合物必须准确的比较它本身的峰强度和其稳定同位素内标化合物的峰强度，或者用该化合物的标准品做校准曲线来实现定量分析。然而，生物样品中磷脂分子不仅数量众多，结构也很复杂，不可能购买到数十个甚至数百个不同的磷脂同位素内标化合物去定量生物样品中数以百计的磷脂组分；且由于商品化的磷脂标准品价格高昂、种类有限，因此通过生物样品中所有磷脂分子的校准曲线来定量显然也十分困难。而影响磷脂分子在质谱中的响应的因素很多：不同种类的磷脂分子因其自身结构(主要是极性头部)及溶液组成的差异而具有不同的离子化倾向，从而具有不同的质谱响应；即使是同类磷脂，其分子中双键数目及酰基链长不同，导致其在质谱检测中具有不同的离子化效率，从而也会表现出不同的响应。如果在进行基于质谱技术的磷脂定量分析时忽略了不同磷脂分子存在的质谱响应差异，将可能导致较大的定量误差。传统的基于质谱技术的磷脂定量方法，通常在每类磷脂中选择一个或者两个生物样品中不含有的磷脂化合物分子作为内标，来实现对生物样品中这类磷脂的定量分析，但是该方法的局限性在于，由于生物样品中存在的磷脂成分非常多，因此很难买到商品化的生物样品中所不含有的磷脂分子标准品来作为内标，更不用说购买到多个结构不同的生物样品中所不含有的磷脂标准品来作为内标进行精确定量分析了。多数情况下还需要自行合成生物样品中所不含有的磷脂分子来作为内标化合物，非常繁琐和费时。此外，如果受条件限制(需要找到生物样品中所不含有的磷脂分子来作为内标)，每类磷脂只能采用一种内标化合物来进行定量，由于即使是同类磷脂，其分子中双键数目及酰基链长不同，其在质谱检测中也会表现出截然不同的响应，因此会导致较大的定量误差且和磷脂内标的碳数和双键数相差越多，定量结果越不准确。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足而提供一种磷脂的精确定量分析方法，每类磷脂中可以随意选择多个商品化的磷脂分子作为内标，同时准确性高，对于不同碳链长度和不同双键数的磷脂分子定量误差小。本专利技术为解决上述提出的技术问题，所采用的技术方案为：一种磷脂的精确定量分析方法，包括如下步骤：1)选取衍生试剂及其相应的稳定同位素衍生试剂；2)从每类磷脂均选择三个或三个以上不同碳链长度、不同双键数的磷脂标品，配制成一类或多类磷脂的混合标准溶液，采用步骤1)所述衍生试剂进行轻标记后，得到磷脂标品轻标记衍生物的混合标准溶液，作为内标溶液；3)待测样品中的磷脂经提取后，采用步骤1)所述相应的稳定同位素衍生试剂发生衍生化反应进行重标记后，平行定量加入步骤2)所得内标溶液，然后进行质谱分析采集质谱图；4)对于每类磷脂，以步骤2)所选择的每一种磷脂标品轻标记衍生物的质荷比为横坐标，根据质谱图所得每类磷脂标品轻标记衍生物在摩尔数相同的条件下所对应的相对丰度值为纵坐标，建立每类磷脂的校准曲线；5)待测样品中磷脂所对应轻标记衍生物R的质荷比记为MR，将MR代入该类别磷脂的校准曲线，计算R的质谱相对丰度理论值I；根据质谱图所得待测样品中的磷脂重标记衍生物的相对丰度测量值为IR，计算待测样品中磷脂所对应衍生物的摩尔数nR＝(n)(IR)/I，即为待测样品中磷脂的摩尔数，进一步计算得到待测样品中磷脂的含量。按上述方案，所述步骤2)中磷脂的混合标准溶液可以为一类或者多类磷脂的混合标准溶液，一般配制一个混合标准溶液即可，如配制成多个混合溶液就要分别进行衍生反应，当然可行，但较为繁琐。磷脂的混合标准溶液中磷脂的类别主要根据目标物来决定，例如如果分析的目标物中只有一类磷脂，那么可以选择这一类磷脂单独做混合标准溶液。按上述方案，所述磷脂为六大类磷脂，包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA)。按上述方案，步骤1)中的化学衍生试剂及其相应的稳定同位素标记试剂均能与磷脂分子中的羟基或氨基等活性基团发生反应，从而对磷脂分子分别进行轻标记和重标记，产生物理和化学性质相同但分子量存在差异的磷脂衍生化产物。按上述方案，所述步骤2)中从选择三个或三个以上不同碳链长度、不同双键数的磷脂时，至少选择一个具有较低碳数及较少双键数的磷脂标准品；至少选择一个具有中等碳数和中等双键数的磷脂标准品；及至少选择一个具有较高碳数和较多双键数的磷脂标准品。其中，所述较低碳数及较少双键数为小于待测样品中的磷脂的最小碳数和双键数；其中，较高碳数及较多双键数为大于待测样品中的磷脂的最大碳数和双键数；中等碳数和中等双键数介于较低碳数及较少双键数、较高数及较多双键数之间。这样能有效保证所得到的校准曲线的质荷比范围能覆盖实际待测样品中待测磷脂的质荷比范围，从而对具有不同质荷比的待测磷脂分子的质谱丰度值进行校正，校准由于碳链长度和不饱和度不同对磷脂定量产生的影响，实现复杂待测样品中存在的数以百计的磷脂化合物的精确定量分析。按上述方案，所述混合标准溶液优选采用氯仿/甲醇＝2:1(v/v)溶剂配制。按上述方案，所述混合标准溶液中各磷脂的浓度优选在0.1-5nmol/mL范围内。按上述方案，所述步骤3)中待测磷脂提取液优选通过液液萃取方法获得，待测样品为生物组织样品或生物体液样品。按上述方案，若步骤2)混合标准溶液中，各类别的每种磷脂的摩尔数相同，则步骤4)中直接以步骤3)所采集质谱图中的相对丰度值为纵坐标；若所述步骤2)混合标准溶液中，各类别的每种磷脂的摩尔数不相同，则步骤4)中需要将其步骤3)所采集质谱图中的相对丰度值统一换算为摩尔数为n时所对应的相对丰度值，然后步骤4)中以摩尔数均为n的条件下所对应的相对丰度值为纵坐标。以其中一类磷脂-磷脂酰乙醇胺PE为例，具体说明如下：若步骤2)中磷脂酰乙醇胺选择标准品PE12:0-12:0，PE16:0-18:1和PE24:1-24:1配制混合标准溶液，进行衍生化反应以轻标记后作为内标，分别记为IS1，IS2和IS3。若IS1，IS2和IS3的摩尔数相同，均为n，质荷比m/z分别为M1，M2和M3，其在步骤3)所采集质谱图中的相对丰度值分别为I1，I2和I3，则步骤4)中直接以I1，I2和I3为纵坐标，与之相对应的M1，M2和M3建立校准曲线；若IS1，IS2和IS3的摩尔数不同，分别为n1，n2和n3，质荷本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于它包括如下步骤：1)选取衍生试剂及其相应的稳定同位素衍生试剂；2)从每类磷脂均选择三个或三个以上不同碳链长度、不同双键数的磷脂标品，配制成一类或多类磷脂的混合标准溶液，采用步骤1)所述衍生试剂进行轻标记后，得到磷脂标品轻标记衍生物的混合标准溶液，作为内标溶液；3)待测样品中的磷脂经提取后，采用步骤1)所述相应的稳定同位素衍生试剂发生衍生化反应进行重标记后，平行定量加入步骤2)所得内标溶液，然后进行质谱分析采集质谱图；4)对于每类磷脂，以步骤2)所选择的每一种磷脂标品轻标记衍生物的质荷比为横坐标，根据质谱分析以每类磷脂标品轻标记衍生物在摩尔数相同的条件下所对应的相对丰度值为纵坐标，建立每类磷脂的校准曲线；5)待测样品中磷脂所对应轻标记衍生物的质荷比记为M

【技术特征摘要】
1.一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于它包括如下步骤：1)选取衍生试剂及其相应的稳定同位素衍生试剂；2)从每类磷脂均选择三个或三个以上不同碳链长度、不同双键数的磷脂标品，配制成一类或多类磷脂的混合标准溶液，采用步骤1)所述衍生试剂进行轻标记后，得到磷脂标品轻标记衍生物的混合标准溶液，作为内标溶液；3)待测样品中的磷脂经提取后，采用步骤1)所述相应的稳定同位素衍生试剂发生衍生化反应进行重标记后，平行定量加入步骤2)所得内标溶液，然后进行质谱分析采集质谱图；4)对于每类磷脂，以步骤2)所选择的每一种磷脂标品轻标记衍生物的质荷比为横坐标，根据质谱分析以每类磷脂标品轻标记衍生物在摩尔数相同的条件下所对应的相对丰度值为纵坐标，建立每类磷脂的校准曲线；5)待测样品中磷脂所对应轻标记衍生物的质荷比记为MR，将MR代入该类别磷脂的校准曲线，计算其质谱相对丰度理论值I；根据质谱图所得待测样品中磷脂重标记衍生物的相对丰度测量值为IR，计算待测样品中磷脂所对应衍生物的摩尔数nR＝(n)(IR)/I，即为待测样品中磷脂的摩尔数，进一步计算得到待测样品中磷脂的含量。2.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于所述磷脂为六大类磷脂，包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和磷脂酸。3.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于步骤1)中的化学衍生试剂及其相应的稳定同位素标记试剂均能与磷脂分子中的活性基团发生反应，实现对磷脂分子分别进行轻标记和重标记。4.根据权利要求1所述的一种磷脂的精确定量分析方法，其特征在于所述步骤2)中从每类磷脂选择三个或三个以上不同碳链长度、不同双键数的磷脂标品时，至少选择一个具有较低碳数及较少双键数的磷脂标准品；至少选择一个具有中等碳数和中等双键数的磷脂标准品；及至少选择一个具有较高碳数和较多双键数的磷脂标准品。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：魏芳，王湘，徐淑玲，董绪燕，陈洪，
申请(专利权)人：中国农业科学院油料作物研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42