一株接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌及其培养方法与应用技术

本发明专利技术涉及一株接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌及其培养方法与应用。一株接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ‑1，2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏编号为：CGMCC No.12828。本发明专利技术还涉及该菌株的培养方法与应用。本发明专利技术首次将革兰氏阳性菌红球菌p52与革兰氏阴性菌铜绿假单胞菌结合，获得了具有可降解二苯并呋喃、氯代二苯并呋喃等化合物的铜绿假单胞菌菌株，可用于污水处理或土壤生物修复过程，生长迅速，其中降解质粒在无选择压力条件下连续传代30代后仍有50％的细胞可保持，稳定性强。

Pseudomonas aeruginosa with dioxin degrading plasmid and its culture method and Application

The invention relates to a Pseudomonas aeruginosa which is connected with dioxin degrading plasmid and a culture method and application thereof. A joint with Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas dioxin degradation plasmid aeruginosa) SJCJ August 8, 12016 preserved in general microbial culture collection center Chinese Management Committee, culture collection number: CGMCC No.12828. The invention also relates to the culture method and application of the strain. The invention for the first time, gram positive bacteria and gram negative bacteria Rhodococcus p52 Pseudomonas aeruginosa combination obtained with Pseudomonas aeruginosa strains could degrade two benzofuran, two chloro benzofuran compounds, can be used for sewage treatment and soil bioremediation process, grow rapidly, the continuous passage of degradative plasmid in no choice under pressure after the 30 generation is still 50% of the cells can maintain the stability.

【技术实现步骤摘要】
一株接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌及其培养方法与应用
本专利技术涉及一株接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌及其培养方法与应用，属于生物技术

技术介绍
二噁英是多氯二苯并二噁英和多氯代二苯并呋喃两类物质的合称，包括75种多氯代二苯并二噁英和135种多氯代二苯并呋喃两组化合物；二噁英为强致癌、致突变物质，对人体及各类生物均会造成严重的健康威胁(蒋可，2005)。二苯并呋喃为多氯代二苯并呋喃在无氯取代情况下的母环结构，通常作为研究二噁英类化合物生物降解时模式化合物。二噁英大部分通常以小颗粒的形式存在于大气、土壤和水体之中，国内外学者的研究表明，生物修复是治理二噁英污染的切实有效的方法，分离获得高效降解菌是开展生物修复工作的核心。近些年来国内外研究人员报道了从污染环境中筛选分离了一些降解二噁英的微生物，包括鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)、假单胞菌(Pseudomonas)、红球菌(Rhodococcus)和地杆菌(Terrabacter)。其中假单胞菌及红球菌在环境中分布较广，假单胞菌为革兰氏阴性菌，对各种污染环境的适应力强，生长迅速，但二噁英降解能力相对较弱；而红球菌为革兰氏阳性菌，二噁英降解能力较强，但生长相对缓慢。另一方面，也有研究表明与二噁英降解相关的代谢基因在革兰氏阳性菌(例如红球菌，地杆菌)中呈现一定的保守性，揭示了自然界中这些微生物之间存在着代谢基因的交流(Alyetal.2008；Kasugaetal.2013；Pengetal.2013)，即通过代谢基因的水平转移使得环境中某些细菌获得了污染物降解能力(张瑞福，2005)。细菌间水平基因转移主要是由可移动基因元件引起的，其中质粒DNA是一类重要的可移动基因元件，既能介导基因水平转移，又可在受体生物体内稳定表达且传递给子代，可以通过接合转移在细菌间交换遗传物质。研究表明降解二噁英的细菌含有可自主迁移的代谢质粒，而跟二噁英降解途径有关的降解基因位于质粒上(Pengetal.2013)。降解质粒在同属或属间的迁移及稳定遗传，以及功能基因的表达使得菌株能够通过基因水平转移使其降解性能在微生物之间得到传播，有助于提高微生物清除污染物的效果和开发其在环境生物修复中的应用潜力(柏耀辉，2007)。然而，通过接合方法对已知菌株进行改造，常常存在如下技术难点：i、可自主迁移性的二噁英降解质粒较罕见。质粒接合迁移的发生首要条件是质粒上存在迁移相关元件：迁移起点oriT、与DNA加工有关的蛋白编码基因、与DNA运输有关的通道蛋白的编码基因。目前国际上关于二噁英降解质粒的报道较少，而可自主迁移性二噁英降解质粒的报道则更少；ii、革兰氏阳性菌与阴性菌之间发生质粒接合迁移有难度。国内外的理论与实验研究表明，供体生物与受体菌之间系统发育距离越近，发生基因水平转移的可能性就越高。采用质粒供体菌为革兰氏阳性菌—红球菌属(Rhodococcus)，受体菌为革兰氏阴性菌—假单胞菌属(Pseudomonas)，这两个属在系统发育中亲缘关系较远的菌株进行质粒接合迁移的成功率很低。至今国际上未有关于二噁英降解质粒在革兰氏阳性菌与阴性菌之间发生接合迁移的报道；iii、筛选携带可稳定遗传的二噁英降解质粒的受体菌有困难。质粒稳定遗传及降解基因的表达依赖于受体菌，即质粒与宿主菌染色体之间存在协调性；另一方面，二噁英降解质粒为100kb以上的大质粒，在无选择压力时成为宿主菌的生长“负担”，极易丢失。因此即使接合迁移成功，也未必能获得可稳定遗传的质粒携带菌。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一株接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌及其培养方法与应用。本专利技术技术方案如下：一株接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)SJCJ-1，2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCCNo.12828。上述接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)SJCJ-1，其菌落形态与细胞形态特征为：菌落扁平，圆形，边缘整齐，直径2-3mm，表面光滑，产黄色色素；细胞呈球杆状，革兰氏染色为阴性菌。可代谢葡萄糖、木糖，不能利用乳糖、蔗糖。过氧化氢酶阳性，硝酸盐还原酶阴性，脲酶阳性。该菌株能以二苯并呋喃为唯一碳源及能源生长，其生长温度为25～42℃，适宜pH为6.0～8.0，可代谢500mg/L二苯并呋喃、100mg/L氯代二苯并呋喃，如图3、图4、图5所示。上述接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)SJCJ-1的培养方法，步骤如下：(1)将接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)SJCJ-1接种于活化培养基中进行活化培养，制得活化菌株；(2)将步骤(1)制得的活化菌株转接至种子培养基中进行种子培养，制得液体种子；(3)将步骤(2)制得的液体种子转接至扩大培养基中进行扩大培养，经固液分离，制得菌体。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中的活化培养基为含有浓度为450～550mg/L二苯并呋喃的无机盐固体斜面培养基，所述无机盐固体斜面培养基每升组分如下：K2HPO42.7～15g，KH2PO40.8～14g，Na2SO42.0g，MgSO4·7H2O0.2g，NH4NO33g，微量金属盐溶液0.1～1mL，蒸馏水1L，pH7.0，高压蒸汽灭菌121℃，20min。所述微量金属盐溶液，每毫升组分如下：FeCl2·4H2O0.1～0.5g，CoCl2·6H2O0.01～0.06g，MgCl2·4H2O0.01～0.05g，ZnCl20.01～0.03g，H3BO30.01～0.03g，Na2MO4·H2O0.01～0.08g，CaCl2·2H2O0.001～0.01g。根据本专利技术优选的，所述步骤(1)中的活化培养温度为28～32℃，时间为45～52小时。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中的种子培养基与步骤(3)中的扩大培养基均为含有浓度为450～550mg/L二苯并呋喃的无机盐液体培养基，所述无机盐液体培养基每升组分如下：K2HPO42.7～15g，KH2PO40.8～14g，Na2SO42.0g，MgSO4·7H2O0.2g，NH4NO33g，微量金属盐溶液0.1～1mL，蒸馏水1L，pH7.0，高压蒸汽灭菌121℃，20min。所述微量金属盐溶液，每毫升组分如下：FeCl2·4H2O0.1～0.5g，CoCl2·6H2O0.01～0.06g，MgCl2·4H2O0.01～0.05g，ZnCl20.01～0.03g，H3BO30.01～0.03g，Na2MO4·H2O0.01～0.08g，CaCl2·2H2O0.001～0.01g。根据本专利技术优选的，所述步骤(2)中的种子培养为在温度为28～32℃的条件下，振荡培养24～48小时。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中转接的体积百分比为5～10％。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中扩大培养为在温度为28～32℃的条件下，振荡培养24～48小时。根据本专利技术优选的，所述步骤(3)中固液分离为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)SJCJ‑1，2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCC No.12828。

【技术特征摘要】
1.一株接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)SJCJ-1，2016年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCCNo.12828。2.权利要求1所述接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)SJCJ-1的培养方法，其特征在于，步骤如下：(1)将接合有二噁英降解质粒的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)SJCJ-1接种于活化培养基中进行活化培养，制得活化菌株；(2)将步骤(1)制得的活化菌株转接至种子培养基中进行种子培养，制得液体种子；(3)将步骤(2)制得的液体种子转接至扩大培养基中进行扩大培养，经固液分离，制得菌体。3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的活化培养基为含有浓度为450～550mg/L二苯并呋喃的无机盐固体斜面培养基，所述无机盐固体斜面培养基每升组分如下：K2HPO42.7～15g，KH2PO40.8～14g，Na2SO42.0g，MgSO4·7H2O0.2g，NH4NO33g，微量金属盐溶液0.1～1mL，蒸馏水1L，pH7.0；所述微量金属盐溶液，每毫升组分如下：FeCl2·4H2O0.1～0.5g，CoCl2·6H2O0.01～0.06g，MgCl2·4H2O0.01～0.05g，ZnCl20.01～0.03g，H3BO30.01～0.03g，Na2MO4·H2O0.01～0.08g，CaCl2·2H2O0.001～0.01g；优选的，所述步骤(1)中的活化培养温度为28～32℃，时间为45～52小时。4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的种子培养基与步骤(3)中的扩大培养基均为含有浓度为450～550mg/L二苯并呋喃的无机盐液体培养基，所述无机盐液体培养基每升组分如下：K2HPO42.7～15g，KH2PO40.8～14g，Na...

【专利技术属性】
技术研发人员：李力，孙娇，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37