乙肝病毒核心抗原的CTL表位及其相关应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种能有效治疗乙肝及其各种并发症，阻断阻断乙肝病毒通过胎盘传染给胎儿、阻断乙肝病毒通过乳汁传染给母乳喂养的新生儿的，基于DC细胞的乙肝病毒T表位肽。所述T表位肽的氨基酸序列为：QLFHLZLIX(谷氨酰胺-亮氨酸-苯丙氨酸-组氨酸-亮氨酸-Z-亮氨酸-异亮氨酸-X)；其中，氨基酸X和Z为任意氨基酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及乙肝病毒核心抗原的CTL表位及其相关应用。
技术介绍
全世界有超过4亿人感染乙型肝炎病毒，每年有1百万人死于感染综合症，包括肝硬化、肝细胞癌或者其他并发症。现有技术大多采用中药或者西药治疗乙肝，虽然有一定疗效，但是不能根治乙肝或其他并发症，尤其不能有效阻断因乙型肝炎病毒感染所造成的肝脏纤维化和硬化、阻断乙肝病毒通过胎盘传染给胎儿、阻断乙肝病毒通过乳汁传染给母乳喂养的新生儿。肽合成技术目前在国内外有一些机构都有开展，组织相容性复合体(MHC)I类限制性细胞毒性T细胞(CTL)在控制胞内病原体和肿瘤细胞生长中起极为重要的作用。通过蛋白质基本性质分析，疏水性分析，跨膜区预测，信号肽预测，亚细胞定位预测，抗原性位点预测，可以对基因编码蛋白的性质作出初步判断和预测。尤其通过疏水性分析和跨膜区预测可以预测基因是否为膜蛋白。将该212个氨基酸与NCBI数据库中的蛋白片段进行Blast,结果显示100条肽与目标肽有同源性，其中16条同源性100％，84条为99％，而这100条肽均为HBV的precore/core蛋白。利用CLCProteinWorkbench软件对该212个氨基酸的分析，可以得到该蛋白质片段的一般生物学特性。细胞免疫反应在免疫应答过程中起着关键的作用。当外源性抗原被抗原呈递细胞捕获后，蛋白质抗原在内吞系统被降解成多肽片段，其中的免疫原性多肽即T细胞表位与MHCI类分子结合，被转运至APC表面供T细胞受体识别，从而激发细胞免疫应答，发挥免疫调节作用，对其氨基酸序列特征的了解将有助于亚单位疫苗分子的设计与研制以及增加对免疫系统的更进一步理解。因此，对T细胞表位的预测以及在此基础上进行结构改造具有重要的理论价值和实际意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能有效治疗乙肝及其各种并发症，阻断阻断乙肝病毒通过胎盘传染给胎儿、阻断乙肝病毒通过乳汁传染给母乳喂养的新生儿的，基于DC细胞的乙肝病毒T表位肽。具体来说，所述T表位肽的氨基酸序列为：QLFHLZLIX(谷氨酰胺-亮氨酸-苯丙氨酸-组氨酸-亮氨酸-Z-亮氨酸-异亮氨酸-X)；其中，氨基酸X和Z为任意氨基酸。在本专利技术的一个实施方案中，所述氨基酸X选自精氨酸(R)，谷氨酸(E),苯丙氨酸(F)，丝氨酸(S)，色氨酸(W)，异亮氨酸(I)或酪氨酸(Y)。在本专利技术另一个实施方案中，所述氨基酸Z选自精氨酸(R)，谷氨酸(E),亮氨酸(L)，丝氨酸(S)，脯氨酸(P)，异亮氨酸(I)或半胱氨酸(C)。在本专利技术又一个实施方案中，所述T表位肽的氨基酸序列选自：QLFHLELIR，QLFHLELIY或QLFHLPLIY中的一种。本专利技术的另一个目的是提供一种负载所述T表位肽的树突状细胞，其通过以下方法进行制备：1)分离出外周血单核细胞，通过流式细胞仪收集CD14+细胞；在经过GM-CSF和IL-4处理后采用DC培养基进行培养，每隔3天半量更换培养基，使细胞变成明显的树突状；2)在培养10天后，向细胞培养基中添加终浓度为0.1mg/L的T表位肽，继续培养24h后，收获活化的树突状细胞即得。本专利技术对已知的乙肝病毒表位肽进行了氨基酸替换或修饰，从而获得了一种免疫原性较佳的乙肝病毒T表位肽。另外，通过DC细胞体外负载该表位肽，并将成熟的DC细胞输注特定人群体内，特异性的产生针对乙肝病毒感染所带来的危害，尤其是针对慢性乙肝的所产生的清除体内病毒和改善临床症状的作用；阻断因乙型肝炎病毒感染所造成的肝脏纤维化和硬化；阻断乙肝病毒通过胎盘传染给胎儿；阻断乙肝病毒通过乳汁传染给母乳喂养的新生儿。具体实施方式下面将结进一步的详细说明本专利技术。需要指出的是，以下说明仅仅是对本专利技术要求保护的技术方案的举例说明，并非对这些技术方案的任何限制。本专利技术的保护范围以所附权利要求书记载的内容为准。在本专利技术中，所述的表位肽均可以通过标准Fmoc方案进行合成，经HPLC纯化后，其纯度应大于98％；当然也可以将表位肽的氨基酸序列交予专业的多肽合成公司进行合成。实施例1负载表位肽的树突状细胞的抗病毒活性研究负载表位肽的树突状细胞的制备：无菌条件下提取小鼠股骨骨髓细胞，放入PRMI1640培养液(含10％胎牛血清，0.1ml青-链霉素)中吹打混匀，3h后取贴壁细胞加入IL-4(终浓度为500U/ml)和GM-CSF(终浓度为1000U/ml)，于37℃、5％CO2培养箱中培养。每3天半量更换1次培养液，同时加入GM-CSF和IL-4，诱导树突状细胞的生成。培养10天后，加入终浓度0.1mg/L表位肽与1×106个/L的树突状细胞共孵育，37℃，24h，收集所活化的树突状细胞。取6～8周龄雌性HBV转基因Babl/c小鼠，随机分为实验组、对照组和空白组，每组10只，与小鼠尾部皮下注射免疫原，每只100μL，之后每间隔1周，以同样方法加强免疫1次，共免疫3次。对照组以1×106个/L的未负载表位肽的树突状细胞作为免疫原，空白组以生理盐水作为免疫原，实验组以负载不同表位肽的1×106个/L树突状细胞作为免疫原，实验组中各组负载的表位肽的具体序列如下：表位肽序列组1QLFHLELIR组2QLFHLELIY组3QLFHLPLIY组4QLFHLCLII组5QLFHLLLIS1)ELISPOT法检测树突状细胞激发CTL分泌IFN-γ的能力末次免疫后1周，断颈处死小鼠，在无菌条件下取脾脏，，用100目筛网碾磨，收集细胞悬液，用聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离脾淋巴细胞；采用ELISPOT检测试剂盒进行检测，按照试剂盒说明书操作，具体结果如下：2)血清HBVDNA抑制率检测HBVDNA抑制率(％)空白组4.3±0.5对照组8.7±0.7组182.6±7.4组261.3±3.8组356.9±4.1组440.5±3.3组526.7±2.6实施例2负载表位肽的树突状细胞的抗病毒临床研究临床收集200例患者，HBeAg阳性，并且给药前6个月没有进行过抗病毒或免疫调节药物治疗。经检测其HBV-DNA≥1000copies/mL(ALT≥40IU，ALT<40IU)。制备负载表位肽的树突状细胞：采用白细胞分离法分离出患者外周血单核细胞，CD14+细胞选择的纯度达到94％。在经过GM-C本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于DC细胞的乙肝病毒T表位肽，所述T表位肽的氨基酸序列为：QLFHLZLIX(谷氨酰胺‑亮氨酸‑苯丙氨酸‑组氨酸‑亮氨酸‑Z‑亮氨酸‑异亮氨酸‑X)；其中，氨基酸X和Z为任意氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种基于DC细胞的乙肝病毒T表位肽，所述T表位肽的氨基酸序列为：QLFHLZLIX(谷氨酰胺-亮氨酸-苯丙氨酸-组氨酸-亮氨酸-Z-亮氨酸-异亮氨酸-X)；其中，氨基酸X和Z为任意氨基酸。
2.根据权利要求1所述的乙肝病毒T表位肽，其特征在于，所述氨基酸X选自精氨酸(R)，谷氨酸(E),苯丙氨酸(F)，丝氨酸(S)，色氨酸(W)，异亮氨酸(I)或酪氨酸(Y)。
3.根据权利要求1所述的乙肝病毒T表位肽，其特征在于，所述氨基酸Z选自精氨酸(R)，谷氨酸(E),亮氨酸(L)，丝氨酸(S)，脯氨酸(P)，异亮氨酸(I)或半胱氨酸(C)。

【专利技术属性】
技术研发人员：阎平希，罗进，闫小君，
申请(专利权)人：江苏安泰生物技术有限公司，阎平希，
类型：发明
国别省市：江苏;32