一种促进神经干细胞增殖和分化的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种促进神经干细胞增殖和分化的培养方法，将外源性神经营养因子作用于培养的神经干细胞，诱导其增殖和分化成神经元；其中，所述外源性神经营养因子为一种多肽，其序列如SEQ ID NO.1所示；还包括将所述外源性神经营养因子与强化肽联合作用于培养的神经干细胞，诱导其增殖和分化成神经元；所述强化肽为一种寡肽，其序列如SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。本发明专利技术提供的方法通过补充外源性神经营养因子，可以显著促进神经干细胞的增殖和向神经元方向的分化；强化肽可以强化外源性神经营养因子的促进增殖和诱导分化作用，效果显著。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物领域，涉及干细胞的培养，具体涉及一种促进神经干细胞增殖和分化的培养方法，用于促进神经干细胞的增殖和向神经元方向的分化。
技术介绍
神经干细胞(NeuralStemCells，NSCs)是干细胞的一种，是存在于脑和脊髓中的未分化细胞。与其他干细胞一样，神经干细胞也具有分裂增殖和多样分化的榜点，具备自我更新能力。它能够分化为神经元、神经胶质细胞等多种类型的神经组织细胞。神经千细胞的各种功能是通过神经元和神经胶质细胞共同完成的，当中枢神经系统中的许多疾病，如：脑损伤、脑出血、帕金森病等都存在不同程度的神经细胞缺失或变形死亡，并由此引起神经功能的损害，神经干细胞就可分化出新的神经元来代替受损的神经元修复大脑。NSCs具有自我更新及分化能力，这使得NSCs在中枢神经系统损伤等疾病的治疗中提供了新的治疗方法，然而内源性NSCs自身增殖和分化的能力十分有限，且NSCs的增殖和分化并不固定，它受到细胞微环境的动态调节。科研工作者试图通过补充外源性神经营养因子，改善细胞微环境，从而调节NSCs的增殖和分化，但是效果差强人意。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种促进神经干细胞增殖和分化的培养方法，通过补充外源性神经营养因子促进神经干细胞的增殖和向神经元方向的分化。上述目的是通过如下技术方案实现的：一种促进神经干细胞增殖和分化的培养方法：将外源性神经营养因子作用于培养的神经干细胞，诱导其增殖和分化成神经元；其中，所述外源性神经营养因子为一种多肽，其序列如SEQIDNO.1所示。该外源性神经营养因子对神经干细胞增殖和分化的促进作用明显。优选地，所述外源性神经营养因子的浓度为300-900μg/ml。优选地，将所述外源性神经营养因子与强化肽联合作用于培养的神经干细胞，诱导其增殖和分化成神经元；所述强化肽为一种寡肽，其序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。研究发现，序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示的寡肽单独作用于神经干细胞时，没有促进神经干细胞增殖和分化的作用，但是与上述外源性神经营养因子联合使用后，可以显著提高外源性神经营养因子对神经干细胞增殖和分化的作用。优选地，SEQIDNO.2所示强化肽的浓度为120-240μg/ml。优选地，SEQIDNO.3所示强化肽的浓度为150-250μg/ml。优选地，SEQIDNO.4所示强化肽的浓度为80-200μg/ml。优选地，神经干细胞分离培养方法为：取孕14d小鼠，颈椎脱臼法处死后置于75％的乙醇中5min，取出妊娠子宫，预冷D-hank’s冲洗2遍，取出胚胎后剥离大脑皮层，置于预冷D-hank’s液中，眼科剪剪碎并反复吹打，制成细胞悬液，无菌200目钢网过滤并1500r/min离心5min，用DMEM/F12(1:1)培养基重悬细胞，再次吹打，计数，以2×105个/mL接种于改良DMEM/F12(1:1)培养基中，37℃、5％CO2和95％空气条件下培养2-3d，神经干细胞组成初级神经球，继续培养2-3d后用0.25％胰酶配合机械吹打神经球，制成单细胞悬液，以2×105个/mL重新接种于培养基，4-5d为1代进行传代；改良DMEM/F12(1:1)培养基为每100mL的DMEM/F12(1:1)培养基中加200μLB27、200ngbFGF、1万U青霉素和10mg链霉素。优选地，神经干细胞鉴定方法为：取3代神经干细胞悬液消化吹打，单层接种到内置多聚赖氨酸处理过的盖玻片的12孔培养板中，培养3d后，将细胞爬片用PBS冲洗，4％多聚甲醛固定20min，Nestin免疫荧光染色，一抗稀释度1:200，滴加DAPI染核5min，封片，镜检。优选地，用于检测神经干细胞增殖的方法为：将体外分离培养的3代神经干细胞消化吹打呈单个细胞，单层接种到内置多聚赖氨酸处理过的细胞爬片的12孔培养板中，将培养的神经干细胞分为对照组和加药组，于37℃、5％CO2和95％空气条件下培养，加入神经干细胞无血清培养基，培养48h加入BrdU，BrdU终浓度为20ng/L，继续培养2h后收集细胞爬片，进行BrdU染色，一抗稀释度1:200，并滴加DAPI染核，统计BrdU染色阳性细胞数和细胞总数，计算BrdU阳性细胞比率；其中，神经干细胞无血清培养基为DMEM/F12(1:1)培养基。优选地，用于检测神经干细胞分化成神经元的方法为：体外分离培养的3代神经干细胞消化吹打呈单个细胞，单层接种到内置多聚赖氨酸处理过的细胞爬片的12孔培养板中，将培养的神经干细胞分为对照组和加药组，于37℃、5％CO2和95％空气条件下培养，加入神经干细胞分化培养基，培养5d后收集细胞爬片，进行MAP2和GFAP免疫巧光染色一抗稀释度1:200，并添加DAPI染核，统计MAP2或GFAP阳性细胞数和细胞总数，计算MAP2和GFAP阳性细胞比率；其中，神经干细胞分化培养基为含10％胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基。本专利技术的有益效果：本专利技术提供的方法通过补充外源性神经营养因子，可以显著促进神经干细胞的增殖和向神经元方向的分化。附图说明图1：对照组和加药组BrdU染色阳性细胞对比；图2：对照组和加药组MAP2阳性细胞对比；图3：对照组和加药组GFAP阳性细胞对比；图4：对照组和加药组MAP2和GFAP表达量对比。具体实施方式下面结合附图具体介绍本专利技术的技术方案。未详细说明的实验方法均为本领域常规方法，未详细介绍的实验材料均为本领域技术人员可以获得的市售常规材料。实验动物：SPF级2月龄昆明小鼠，雄鼠6只，雌鼠12只，体质量25-30g，由青海大学实验动物中心提供常规饲养。实验试剂：DMEM/F12培养基购自美国Hyclone公司；B27Serum-Frrsupplement、多聚赖氨酸和MTS购自美国Sigma公司；胎牛血清(FBS)、胰酶购自美国Gibco公司；bFGF购自美国R&D公司；抗MAP2单克隆抗体、PVDF膜和Westernblotting化学发光试剂盒购自美国Millipore公司；抗GFAP单克隆抗体购自美国Chemicon公司；一抗稀释液、山羊血清封闭液、PBS缓冲液、FITC和TRITC标记的二抗购自中国北京中杉金桥生物科技有限公司；DAPI、青霉素和链霉素购自中国碧云天生物科技有限公司；蛋白浓度检测BCA试剂盒购自美国Biorad公司；预染蛋白质彩虹Marker购自立陶宛Fermentas公司。实施例1：外源性神经营养因子和强化肽的制备多肽的合成方法已经非常成熟，可以在实验室自己采用固相法合成，也可以直接委托给生物外包公司合成。本专利技术中的涉及的多肽均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并经ESI质谱鉴定，以确保多肽序列正确。Fmoc法固相合成技术：合成反应按照从C端向N端进行，Rink介质上有自由氨基；每一步连接过程中，氨基酸残基都要活化，活化混合物中有4倍于介质上自由氨基的HBTU，HOBt，DIEA和Fmoc-氨基酸；每次氨基酸的连接反应之后，都用一个吡啶/醋酸/N-甲基咪唑(3:2:0.5)的混合物来封闭未连接的自由氨基，封闭反应10分钟；每次氨基酸的连接反应之后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进神经干细胞增殖和分化的培养方法，其特征在于：将外源性神经营养因子作用于培养的神经干细胞，诱导其增殖和分化成神经元；其中，所述外源性神经营养因子为一种多肽，其序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种促进神经干细胞增殖和分化的培养方法，其特征在于：将外源性神经营养因子作用于培养的神经干细胞，诱导其增殖和分化成神经元；其中，所述外源性神经营养因子为一种多肽，其序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的促进神经干细胞增殖和分化的培养方法，其特征在于：所述外源性神经营养因子的浓度为300-900μg/ml。3.根据权利要求1所述的促进神经干细胞增殖和分化的培养方法，其特征在于：将所述外源性神经营养因子与强化肽联合作用于培养的神经干细胞，诱导其增殖和分化成神经元；所述强化肽为一种寡肽，其序列如SEQIDNO.2或SEQIDNO.3或SEQIDNO.4所示。4.根据权利要求3所述的促进神经干细胞增殖和分化的培养方法，其特征在于：SEQIDNO.2所示强化肽的浓度为120-240μg/ml。5.根据权利要求3所述的促进神经干细胞增殖和分化的培养方法，其特征在于：SEQIDNO.3所示强化肽的浓度为150-250μg/ml。6.根据权利要求3所述的促进神经干细胞增殖和分化的培养方法，其特征在于：SEQIDNO.4所示强化肽的浓度为80-200μg/ml。7.根据权利要求1-6任一所述的促进神经干细胞增殖和分化的培养方法，其特征在于，神经干细胞的分离培养方法为：取孕14d小鼠，颈椎脱臼法处死后置于75％的乙醇中5min，取出妊娠子宫，预冷D-hank’s冲洗2遍，取出胚胎后剥离大脑皮层，置于预冷D-hank’s液中，眼科剪剪碎并反复吹打，制成细胞悬液，无菌200目钢网过滤并1500r/min离心5min，用DMEM/F12(1:1)培养基重悬细胞，再次吹打，计数，以2×105个/mL接种于改良DMEM/F12(1:1)培养基中，37℃、5％CO2和95％空气条件下培养2-3d，神经干细胞将组成初级神经球，继续培养2-3d后用0.25％胰酶配合机械吹打神经球，制成单细胞悬液，以2×105个/mL重新接种于培养基，4-5d为1代进行传代；所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨廷伟，刘翠红，崔长年，陈四海，朱荣富，赵元英，朱晓翔，谷鹏飞，陈子扬，邓凯旋，
申请(专利权)人：青海七彩花生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：青海;63