本发明专利技术公开了氯化两面针碱在抗骨质疏松症及防治破骨细胞引起的骨丢失疾病中的应用，申请人首次研究发现氯化两面针碱剂量依赖性抑制破骨细胞形成和骨吸收功能；发现氯化两面针碱通过干预 RANKL 激活的 NF‑κB 和 NFAT 信号通路发挥其抑制破骨细胞的作用；并通过建立了小鼠去卵巢骨质疏松模型进一步证明氯化两面针碱对破骨细胞的作用；氯化两面针碱可作为未来防治破骨细胞引起的骨丢失疾病的一个理想药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物，具体涉及制备新适应证的药物，尤其涉及氯化两面针碱（NitidineChloride）在制备抗骨质疏松症和骨丢失药物中的应用。。
技术介绍
骨质疏松症是多种原因引起的一组骨病，骨组织有正常的钙化，钙盐与基质呈正常比例，以单位体积内骨组织量减少为特点的代谢性骨病变。在多数骨质疏松中，骨组织的减少主要由于骨质吸收增多所致。以骨骼疼痛、易于骨折为特征。破骨细胞(osteoclast)是骨组织成分的一种，行使骨吸收的功能。破骨细胞起源于骨髓造血干细胞/单核细胞系统，是一种高度分化的多核细胞，其分化主要依赖于RANKL的刺激。RANKL属于肿瘤坏死因子超家族成员，由成骨细胞，软骨细胞与骨细胞分泌而来。在骨微环境中，RANKL与前破骨细胞表面受体RANK结合，募集RANK信号传导的转接蛋白TRAF6，启动下游信号通路包括NF-κB，MAPK，NFAT，AKT以及钙离子通道，促进破骨细胞分化成熟。其中NF-κB是破骨细胞分化成熟的关键信号，而NFAT介导细胞融合和破骨细胞分化，是破骨细胞终端分化的转录因子。同时，RANKL还需要免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM）介导的信号通路（其中包括破骨细胞相关受体（OSCAR），髓样细胞触发受体-2（TREM2），Fc受体共同γ链（FcRγ），以及DNAX活化蛋白12（DAP12）），来共同激活NFAT，致使破骨细胞分化，发挥细胞功能。当前，治疗骨丢失疾病的方法多采用以下几种：一、骨吸收抑制剂治疗，例如双磷酸盐；二、激素替代疗法。但是，研究发现应用激素替代疗法，女性患乳腺癌的风险增大，并且抑制骨吸收的磷酸盐制剂也在临床应用中出现了较大的不良反应，这极大限制了临床推广。因此，寻找可以防治骨丢失疾病的药物一直是人们梦寐以求的愿望。近几年，中草药的治疗骨丢失疾病的研究逐渐开展起来。由于中草药治疗效果明显且安全性较好，目前，已经发现部分中草药单体具有抑制破骨细胞的作用，例如芒果苷，柚皮苷等。两面针为芸香科植物两面针Zanthorμlumnitidum(Roxb.)DC.的干燥根，性味苦、辛，具有跌打损伤、活血化瘀等功效，是广西特有中草药。氯化两面针碱是两面针主要活性成分之一。既往的研究主要集中在抗肿瘤以及抗炎的治疗。目前对破骨细胞形成的作用尚未有报道。申请人研究氯化两面针碱对骨质疏松症的调控作用，通过TARcP染色发现氯化两面针碱呈剂量依赖性抑制RANKL诱导的破骨细胞形成与骨吸收作用；同时还发现1µM氯化两面针碱也能够干预人外周血单个核细胞体外诱导破骨细胞成熟分化。从作用机制上显示，氯化两面针碱是通过抑制RANKL激活的NF-κB与NFATc1信号通路来发挥作用，并下调了破骨细胞成熟分化标志基因（cathepsinK，D2，calcitoninreceptor，NFATc1，TRAcP，OSCAR，FcRγ，TREM2，DAP12）的表达。再通过建立去卵巢小鼠的骨质疏松症模型表明氯化两面针碱可以保护卵巢切除导致的骨丢失。从HE染色及组织病理学结果分析，与去卵巢小鼠组相比，氯化两面针碱治疗组明显降低了骨组织中破骨细胞的数量。基于上述药理作用，可拟开发氯化两面针碱为制备治疗骨质疏松症和骨丢失的药物。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于研究氯化两面针碱对破骨细胞的调控作用，设计在抗骨质疏松症药物中的应用。本专利技术提供了氯化两面针碱在制备康骨质疏松症药物中的应用。申请人首次研究发现氯化两面针碱剂量依赖性抑制破骨细胞形成和骨吸收功能；发现氯化两面针碱通过干预RANKL激活的NF-κB和NFAT信号通路发挥其抑制破骨细胞的作用。为了进一步证明氯化两面针碱对破骨细胞的作用，建立了小鼠去卵巢骨质疏松模型。结果表明，氯化两面针碱给药组能够防治去卵巢诱发的骨丢失。综上所述，氯化两面针碱通过下调RANKL激活的NF-κB和NFAT来干预破骨细胞分化功能。附图说明图1两面针碱对RANKL诱导的破骨细胞形成以及破骨细胞增殖、凋亡的影响（A：两面针碱化学结构。B：BMMs在含有100ng/mL的M-CSF，100ng/mL的RANKL以及不同浓度的两面针碱的细胞分化液中培养5天，然后进行TRAcP染色。光学显微镜下观察两面针碱呈剂量依赖性的抑制RANKL诱导的破骨细胞形成。C：对TRAcP染色阳性多核细胞进行计数，对于细胞核≥3归为破骨细胞；D：利用AnnexinV凋亡试剂盒检测不同浓度两面针碱对破骨细胞的细胞凋亡的影响；E：利用MTS考察两面针碱对BMMs孵育48小时后，药物对细胞增殖的影响。*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.001）图2两面针碱对RANKL诱导破骨细胞分泌的特异性基因的影响（BMMs在含有100ng/mL的M-CSF，100ng/mL的RANKL以及不同浓度的两面针碱（0，0.125，0.25，0.5以及1µM）的细胞分化液中培养7天。利用RT-PCR检测相关基因的mRNA表达水平。结果用ImageJ分析各条带的灰度值，计算目的基因灰度值与GAPDH灰度值的比值，即为各自mRNA的相对表达水平，分析各组之间的差异）图3两面针碱对骨吸收功能的影响（经RANKL诱导BMMs分化后的破骨样细胞，按照相同的数目接种于骨板上，并加入含有RANKL以及不同浓度的两面针碱的完全培养基进行孵育48h；对照组只含有RANKL的完全培养基。A：通过SEM观察各组的骨吸收面积（黑色箭头标示）B：对骨吸收面积进行定量分析。*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.001)图4两面针碱对RANKL诱导的人外周血提取单核细胞相关基因的表达以及骨吸收功能作用（A：通过定量PCR比较，与只含有RANKL的完全培养基处理的阳性对照组比较，1µM两面针碱药物处理组对RANKL诱导的人外周血提取单核细胞相关基因表达情况的影响；每个目的基因与相应的GAPDH，进行比较循环阈值对目的基因进行计算；B：RANKL诱导的人外周血提取单核细胞分化后的破骨样细胞，按照相同的数目种于骨板上，并加入含有RANKL以及不同浓度的两面针碱进行孵育48h；对照组只含有RANKL的完全培养基。通过SEM观察各组的骨吸收面积；C：对骨吸收面积进行定量分析。*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.001）图5两面针对RANKL引起的IκBα降解的影响（采用稳定转染3κB-Luc-SV40荧光素酶报告基因的Raw264.7，检测硫酸小檗碱对RANKL活化NF-κB的影响。A：RAW264.7细胞分为3组，阴性对照组含有完全培养基；阳性对照组含有100ng/mLRANKL完全培养基；给药组含有100ng/mLRANKL与不同浓度的两面针碱（0.5uM和1uM）的完全培养基。将各组数据进行比较，分析各组中各组中NF-κB蛋白的表达情况。B：两面针碱对BMMs进行预孵育1h，然后按照时间点加入100ng/ml的RANKL进行刺激。将β-actin最为内参，Western-blot定量分析IκBα的表达。*p＜0.05，**p＜0.005，***p＜0.001）图6两面针碱对RANKL活化的NFATc1的作用（采用稳定转染pNFATc1-TA-Luc荧光素酶报告基因的Raw264.7，本文档来自技高网...
【技术保护点】
氯化两面针碱在制备抗骨质疏松症药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.氯化两面针碱在制备抗骨质疏松症药物中的应用。2.氯化两面针碱在制备防治破骨细胞引起的骨丢失疾病药物中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述药物由氯化两面针碱作为活性成分与药用载体组成的制剂。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为口服剂型、注射剂、栓剂或外用剂型。5.根据权利要求3所述的应用...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘倩，徐家科，王涛，蒋伟哲，赵劲民，
申请(专利权)人：刘倩，徐家科，王涛，蒋伟哲，
类型：发明
国别省市：广西;45
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