本发明专利技术提供了一种生产间苯三酚的海藻附生假单胞菌及其人工培养方法。由渤海潮间带海藻分离获得赛维瓦尔假单胞菌，在海藻粉10-12g/L，蛋白胨5-7g/L，甘油7-10mL/L，K2HPO4 1.5-2.0g/L，MgSO4.7H2O1.5-2.0g/L，NaCl 15.0-20.0g/L，琼脂16-18g，pH7.0-7.5的固体培养基中25℃-28℃培养45-48h，将菌体刮下接入同配方(无琼脂)的培养液中，150rpm振荡培养35-40h，再将该种子液接入所需体积的上述培养液中，25℃-28℃，150rpm振荡培养65-72h获得发酵液，将发酵液常规方法处理即得间苯三酚。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于海洋微生物资源领域，具体的说是由海藻分离获得的假单胞菌(Pseudomonasthivervalensis)，菌株号TBF-165，通过人工培养发酵，可产生用途广的间苯三酚。该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏日期2015年5月29日，保藏编号CGMCCNo.10934，分类命名赛维瓦尔假单胞菌Pseudomonasthivervalensis。
技术介绍
间苯三酚用途广，是重要的化工和医药中间体，可用于化工、医药、材料领域，如染料偶合、合成橡胶、轮胎增粘、纺织品与皮革染色等；同时也是性能优越的抗氧化剂和化学防腐剂，还可用于检验香草素、木质素、糖醛、多缩戊糖等；间苯三酚还是重要的制备心血管系统、抗癌、抗艾滋病及肝炎药物中间体，尤其是近几年黄酮类药物的兴起，更是凸显了间苯三酚的供需矛盾。间苯三酚市场需求量大，经济价值较高，目前国内外生产主要靠化学合成，常用的2，4，6-三硝基甲苯为原料，经间苯三胺途径工业化生产间苯三酚的方法，污染环境且存在安全隐患；苯卤化物为原料成本高，工艺复杂，难于工业化生产；而以1，3，5-三异丙基苯为原料的工艺路线，虽然污染小，成本较低，但氧化阶段产物复杂，分离精制较困难。亟待探索对环境友好的生物生产途径来解决该难题。与其它生物途径获得间苯三酚相比，微生物具有可人工培养发酵，成本低，产物的得率和纯度较高，容易工业化生产的优势。微生物生产最重要的是种质资源，因此获得产品的新种质资源是各国争夺自主知识产权的目标。有报道推测荧光假单胞菌，产生2，4-二乙酰基间苯三酚的同时也产生间苯三酚，但未见荧光假单胞菌产生间苯三酚的科研证实，也未见有关假单胞菌属其它种类菌产生间苯三酚的报道，更没有关于海洋生境微生物产生间苯三酚的科研报道。我国是海洋大国，海洋微生物资源很丰富，而相对于开发时间较久的陆地微生物，这一生境宝贵资源的开发时间较短，发现有用化合物的机率相对较大，我们由渤海采集的海藻分离获得一株假单胞菌可以产生间苯三酚，该菌株对环境没有污染，菌株人工培养容易，所需培养材料价格低廉，各地市场可随处购买，培养周期短，容易实现产业化，开发前景好。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株新发现的海洋生境假单胞菌Pseudomonasthivervalensis，该菌能通过人工培养方法生产间苯三酚。专利技术充分利用了海洋微生物这一新开发的天然资源，菌株经测定生物学及化学特性稳定，容易培养，培养周期短，操作方法简便可行，对环境没有污染，所用原料廉价，生产成本低，容易实现产业化，开发前景好。本专利技术的目的是由以下技术方案实现的，由渤海潮间带海藻分离获得了一株产间苯三酚新资源菌株，赛维瓦尔假单胞菌Pseudomonasthivervalensis菌株，菌株编号TBF-165，保藏编号为：CGMCCNo.10934。1)培养基配方为：蛋白胨15-20g/L，甘油7-10mL/L，K2HPO4，1.5-2.0g/L；MgSO4.7H2O1.5-2.0g/L，NaCl8.0-10.0g/L，pH7.0-7.5，琼脂16-18g；保藏编号为：CGMCCNo.10934的TBF-165菌株，接入在上述培养基置25℃-28℃培养常规培养40-48小时，菌落表面光滑不透明，浊黄红色，在MPDA培养基上菌落呈蓝色，菌体杆状，直或微弯曲，革兰氏染色阴性，0.4-1.3μm×1.4-5.0μm，无荚膜与芽胞，极生鞭毛。生理生化特征：TBF-165菌株能在5％-10％NaCl的环境生长，明胶酶试验、硝酸盐还原、接触酶试验为阳性；淀粉水解、VP试验、吲哚反应为阴性，能利用柠檬酸盐和丙酸盐，氧化葡萄糖产酸，不能水解尿素；2)用常规诱变育种与驯化方法对TBF-165菌株进行改造，采用死亡率大于90％紫外(250nm)氯化锂(氯化锂2.0％)复合诱变处理条件，通过生物学菌落特征对比从诱变平板中初步选取菌株，选择的菌株经高效液相色谱HPLC与亲本菌株比较峰值确定产量高的菌株，选出的菌株，加入海藻粉10-12g/L，蛋白胨5-7g/L，甘油7-10mL/L；K2HPO41.5-2.0g/L；MgSO4.7H2O1.5-2.0g/L，NaCl，15.0-20.0g/L，pH7.0-7.5，25℃-28℃，驯化培养30小时，加入55℃水浴热激活10分钟，转入相同的固体培养基纯化为单克隆菌落，连续传代10代，选择生物学与化学性状稳定的菌株做为选育的高产菌株；3)改造好的TBF-165菌株加入海藻粉10-12g/L，蛋白胨5-7g/L，甘油7-10mL/L；K2HPO41.5-2.0g/L；MgSO4.7H2O1.5-2.0g/L，NaCl15.0-20.0g/L，pH7.0-7.5，25℃-28℃，琼脂16-18g，培养40-48小时，将固体培养基生长好的菌体刮下，接入不加琼脂的培养液，转速150rpm，振荡培养35-40小时为种子液，再将种子液接入所需体积的上述培养液中(根据需要可逐级放大)，25℃-28℃，150rpm，振荡培养65-72小时，获得发酵液，培养好的发酵液加入3倍的乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯减压浓缩，即得到间苯三酚。选育的高产菌株产量由野生菌株原来的150mg/L提高到1126mg/L，提高了800.8％，菌株生物学与化学性状稳定本专利技术有益效果：1从海洋微生物中发现一个产间苯三酚的新种质资源，为我国绿色生产国民经济需求量大的间苯三酚提供一个新途径；2为基因控制产间苯三酚提供一个新基因资源。目前虽然有多种产间苯三酚基因报道，但海洋生境微生物生存环境特殊，此菌株具有明显的海洋环境生长特性，其控制间苯三酚产生的基因也是新的基因资源；3与已报道的产间苯三酚菌株相比，该菌株生长温度低，可节省能源，能利用资源丰富廉价的海藻，生产成本低，操作简单，开发前景好，容易实现产业化。附图说明图1是野生菌株与高产菌株产生间苯三酚HPLC测试峰比较图。具体实施方式本专利技术的保护范围不仅局限于以下实施例中，本专利技术的具体技术步骤如下：实施例1：TBF-165菌株的培养性状及生理生化测试以保藏编号为：CGMCCNo.10934的TBF-165菌株，经蛋白胨15-20g/L，甘油7-10mL/L；K2HPO41.5-2.0g/L；MgSO4.7H2O1.5-2.0g/L，NaCl20.0-30.0g/L，琼脂16-18g，pH7.0-7.5，25℃-28℃，培养40-48小时，前期浊白色，后转变为浊红色，菌体杆状，直或微弯曲，革兰氏染色阴性，0.4-1.3μm×1.4-5.0μm，无荚膜与芽胞，极生鞭毛，常规生理生化测试结果如下表，结合16SrDNA测试结果，鉴定TBF-165菌株为假单胞菌属的赛维瓦尔Pseudomonasthivervalensis种。菌株TBF-165生理生化特征菌株培养40-48小时为一代，连续在相同培养基传代接种10代后，与原始菌株进行对比，各种性状相同，证明菌株生物学性状稳定。实施例2：高产菌株的选育为提高产量，降低成本，用常规诱变育种与驯化方法对TBF-165菌株进行，采用选取死本文档来自技高网...
【技术保护点】
产间苯三酚的海藻附生假单胞菌及人工培养方法，由渤海潮间带海藻分离获得了一株产间苯三酚的新资源菌株，赛维瓦尔假单胞菌Pseudomonas thivervalensis菌株，菌株编号TBF‑165，保藏编号为：CGMCC No.10934：1)培养基配方为：蛋白胨15‑20g/L，甘油7‑10mL/L，K2HPO4，1.5‑2.0g/L；MgSO4.7H2O 1.5‑2.0g/L，NaCl 8.0‑10.0g/L，pH 7.0‑7.5，琼脂16‑18g；保藏编号为：CGMCC No.10934的TBF‑165菌株，接入在上述培养基置25℃‑28℃常规培养40‑48小时，菌落表面光滑不透明，浊红色，在MPDA培养基上菌落呈蓝色，菌体杆状，直或微弯曲，革兰氏染色阴性，0.4‑1.3μm×1.4‑5.0μm，无荚膜与芽胞，极生鞭毛，生理生化特征：TBF‑165菌株能在5％‑10％NaCl的环境生长，明胶酶试验、硝酸盐还原、接触酶试验为阳性；淀粉水解、VP试验、吲哚反应为阴性，能利用柠檬酸盐和丙酸盐，氧化葡萄糖产酸，不能水解尿素；2)用常规诱变育种与驯化方法对TBF‑165菌株进行改造，采用死亡率大于90％紫外(250nm)氯化锂(氯化锂2.0％)复合诱变处理条件，通过生物学菌落特征对比从诱变平板中初步选取菌株，选择的菌株经高效液相色谱HPLC与亲本菌株比较峰值确定产量高的菌株，选出的菌株，加入海藻粉10‑12g/L，蛋白胨5‑7g/L，甘油7‑10mL/L；K2HPO4 1.5‑2.0g/L；MgSO4.7H2O 1.5‑2.0g/L，NaCl，15.0‑20.0g/L，pH7.0‑7.5，25℃‑28℃，驯化培养30小时，加入55℃水浴热激活10分钟，转入相同的固体培养基纯化为单克隆菌落，连续传代10代，选择生物学与化学性状稳定的菌株做为选育的高产菌株；3)改造好的TBF‑165菌株加入海藻粉10‑12g/L，蛋白胨5‑7g/L，甘油7‑10mL/L；K2HPO4 1.5‑2.0g/L；MgSO4.7H2O 1.5‑2.0g/L，NaCl 15.0‑20.0g/L，pH 7.0‑7.5，25℃‑28℃，琼脂16‑18g，培养40‑48小时，将固体培养基生长好的菌体刮下，接入不加琼脂的培养液，转速150rpm，振荡培养35‑40小时为种子液，再将种子液接入所需体积的上述培养液中，在25℃‑28℃，150rpm，振荡培养65‑72小时，获得发酵液，培养好的发酵液加入3倍的乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯减压浓缩，得到间苯三酚，选育的高产菌株产量由野生菌株原来的150mg/L提高到1126mg/L，提高了800.8％，菌株生物学与化学性状稳定。...
【技术特征摘要】
1.产间苯三酚的海藻附生假单胞菌及人工培养方法，由渤海潮间带海藻分离获得了一株产间苯三酚的新资源菌株，赛维瓦尔假单胞菌Pseudomonasthivervalensis菌株，菌株编号TBF-165，保藏编号为：CGMCCNo.10934：1)培养基配方为：蛋白胨15-20g/L，甘油7-10mL/L，K2HPO4，1.5-2.0g/L；MgSO4.7H2O1.5-2.0g/L，NaCl8.0-10.0g/L，pH7.0-7.5，琼脂16-18g；保藏编号为：CGMCCNo.10934的TBF-165菌株，接入在上述培养基置25℃-28℃常规培养40-48小时，菌落表面光滑不透明，浊红色，在MPDA培养基上菌落呈蓝色，菌体杆状，直或微弯曲，革兰氏染色阴性，0.4-1.3μm×1.4-5.0μm，无荚膜与芽胞，极生鞭毛，生理生化特征：TBF-165菌株能在5％-10％NaCl的环境生长，明胶酶试验、硝酸盐还原、接触酶试验为阳性；淀粉水解、VP试验、吲哚反应为阴性，能利用柠檬酸盐和丙酸盐，氧化葡萄糖产酸，不能水解尿素；2)用常规诱变育种与驯化方法对TBF-165菌株进行改造，采用死亡率大于90％紫外(250nm)氯化锂(氯化锂2.0％)复合诱变处理条件，通过生物学菌落特征对比从诱变平板中初步选取菌株，选择的菌株经高效液相...
【专利技术属性】
技术研发人员：林文翰，田黎，张久明，刘东，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：北京;11
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