一种透明质酸‑甲基纤维素复合凝胶的活性酯交联方法技术

本发明专利技术属于生物医用材料及组织工程技术领域，具体涉及一种透明质酸‑甲基纤维素复合凝胶的活性酯交联方法。聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐和去乙酰化透明质酸反应得到交联活性酯，所述交联活性酯与甲基纤维素交联，形成透明质酸‑甲基纤维素复合凝胶。本发明专利技术所述复合凝胶具有更好的注射性和流变学性能，有利于受损中枢神经的微创修复，减少了对细胞的刺激，具有更好的细胞相容性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医用材料及组织工程
，具体涉及一种透明质酸-甲基纤维素复合凝胶的活性酯交联方法。
技术介绍
透明质酸(HyaluronicAcid，HA)是一种线性多糖，广泛存在于细胞外基质中，具有优异的非抗原性和细胞相容性等，同时其溶液的高粘弹性使之在临床医学领域应用中具有良好的分离、保护、充填作用，是一种备受青睐的天然高分子材料。当用于体内的受损神经修复时，透明质酸存在水溶性过高、不能维持正常的体内形态以及降解速度过快等不足，因此常与其它天然或人工合成材料结合使用。通过复合剪切自稀的透明质酸与热逆性的甲基纤维素(MethylCellulose，MC)可以形成一种快速凝胶化的可注射凝胶——透明质酸-甲基纤维素复合凝胶(以下简称HAMC)。HAMC在注射前是一种溶胶，在注射后由于体内温度相对于室温温度的升高，凝胶强度增强。HAMC复合物相比于甲基纤维素单独存在时拥有更低的凝胶化温度和较小的触变环，这些影响归因于透明质酸的阴离子羧酸盐基团。除了可以快速凝胶化以外，HAMC是非细胞粘附的，具有可降解性，并在鞘内空间具备生物相容性。研究结果表明，相对于透明质酸自身，经过了化学修饰后得到的透明质酸衍生物，其化学稳定性将会提高，抗降解性能也将被改善，在动物体内的半衰期有所延长，但其生物相容性以及生物活性不会有大的改变。将聚乙二醇分子进行酯化，再使透明质酸在碱性环境中经乙酰化处理产生氨基，二者于室温下共价反应即可产生透明质酸-聚乙二醇衍生物(HA-PEG)。对该衍生物材料进行流变性能的测试，结果显示，改性后的透明质酸衍生物材料属于非牛顿流体，具有高聚物的粘弹性，符合医用生物材料要求。
技术实现思路
本专利技术提供了一种透明质酸-甲基纤维素复合凝胶的活性酯交联方法，具体技术方案如下：一种透明质酸-甲基纤维素复合凝胶的活性酯交联方法：聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐和去乙酰化透明质酸反应得到交联活性酯，所述交联活性酯与甲基纤维素交联，形成透明质酸-甲基纤维素复合凝胶。具体操作为：(一)制备聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐(PEG-SS)：(1)将分子量为6000的聚乙二醇，溶解于二氧六环中，以吡啶作为催化剂，加入琥珀酸酐，加热状态下回流搅拌，反应完毕后冷却，在快速搅拌下滴加无水乙醚至沉淀不再产生，之后置于冰浴中搅拌，过滤后将沉淀充分溶解于二氯甲烷中，再次滴加无水乙醚至沉淀不再产生，冰浴搅拌，将过滤得到的沉淀真空干燥；(2)将步骤(1)得到的沉淀与N-羟基琥珀亚酰胺溶于含有二环己基碳化二亚胺(DCC)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，搅拌12h后，在快速搅拌下滴加无水乙醚至沉淀不再产生，之后置于冰浴中搅拌，过滤后将沉淀充分溶解于二氯甲烷中，再次滴加无水乙醚至沉淀不再产生，冰浴搅拌，过滤，用无水乙醚多次洗涤，将沉淀进行真空干燥，得到所述的聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐。优选地，聚乙二醇、琥珀酸酐、吡啶、N-羟基琥珀亚酰胺、二环己基碳化二亚胺的摩尔比依次为1：1：0.695：2.453：2.563；聚乙二醇与各溶剂的质量体积比为聚乙二醇：二氧六环：步骤(1)中所用的二氯甲烷：步骤(2)中所用的二氯甲烷：N,N-二甲基甲酰胺＝0.48g：20mL：30mL：30mL：1mL。优选地，步骤(1)中，回流搅拌时的温度为100℃，搅拌时间为4h；步骤(1)和步骤(2)中，两次冰浴搅拌的时间均为：首次搅拌30min，第二次搅拌15min。(二)制备去乙酰化透明质酸：向透明质酸的水溶液中滴加氢氧化钠溶液，缓慢搅拌，使透明质酸与氢氧化钠溶液充分接触，反应2h，得到去乙酰化透明质酸。优选地，所述透明质酸水溶液的浓度为9.8×10-3mol/L，氢氧化钠溶液的浓度为1mol/L；氢氧化钠溶液的添加量以调节pH值至12.65±0.05为准。(三)透明质酸-甲基纤维素复合凝胶的活性酯交联方法：(1)将预先配制好的第一份人工脑脊液加热至90℃，加入一定量的氯化钠、磷酸钠和甲基纤维素，搅拌均匀后再加入等体积的第二份人工脑脊液，-4℃冰盐浴中搅拌40min，得到甲基纤维素溶液，4℃冷藏过夜；(2)将聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐配制成水溶液，加入去乙酰化透明质酸溶液中，搅拌使溶液混合均匀，室温下反应12h，再向溶液中加入质量分数为95％的乙醇至沉淀产生完全，过滤收集沉淀，用乙醇洗涤沉淀3次以上，真空干燥，得到交联活性酯；(3)称取一定量的交联活性酯加入甲基纤维素溶液中，调节pH至7.4，搅拌2h以上使交联活性酯充分分散且溶解均匀，4℃冷藏过夜，并对其冷冻干燥，得到透明质酸-甲基纤维素复合凝胶。优选地，氯化钠、磷酸钠、甲基纤维素、去乙酰化透明质酸的质量之比依次为(2～4)：(0～0.05)：7：1。优选地，步骤(2)中，聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐水溶液的浓度为1×10-3mol/L，与去乙酰化透明质酸溶液的体积比为1：10。如上所述方法制备得到的透明质酸-甲基纤维素复合凝胶。本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术中，聚乙二醇在琥珀酸酐和N-羟基琥珀酰亚胺作用下形成聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐，然后与去乙酰化透明质酸溶液反应得到交联活性酯，交联活性酯与甲基纤维素反应得到终产物——复合凝胶。所述复合凝胶保持了原透明质酸-甲基纤维素凝胶的空间多孔结构、良好的力学性能和生物相容性，且从透明质酸分子的角度出发，通过结构改造降低了其降解速率，延长了体内存留时间，因此复合凝胶中原本用于延缓降解的甲基纤维素成分比例得以减少，使凝胶具有更好的注射性和流变学性能，有利于受损中枢神经的微创修复。(2)本专利技术在对透明质酸-甲基纤维素复合凝胶成胶温度的调控中，尝试改变单一的氯化钠添加剂形式，加入少量磷酸钠以减少氯化钠的用量。该方法使复合凝胶保持了体温下成胶能力，并具有更接近人体体液的渗透压环境，减少对细胞的刺激，获得更好的细胞相容性。附图说明图1为实施例1中复合凝胶在扫描电镜下的微观形貌图。图2为实施例1中复合凝胶在37℃下的G’(ω)和G”(ω)曲线图。图3为实施例1中复合凝胶在3周内的降解情况曲线图。图4为不同交联方式下添加3.75wt％NaCl的复合凝胶在3周内的降解情况曲线图。图5为不同交联方式下添加4wt％NaCl的复合凝胶在3周内的降解情况曲线图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步的说明。实施例1(一)制备聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐(PEG-SS)：(1)将2.4g聚乙二醇(分子量为6000)溶解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种透明质酸‑甲基纤维素复合凝胶的活性酯交联方法，其特征在于，聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐和去乙酰化透明质酸反应得到交联活性酯，所述交联活性酯与甲基纤维素交联，形成透明质酸‑甲基纤维素复合凝胶。

【技术特征摘要】
1.一种透明质酸-甲基纤维素复合凝胶的活性酯交联方法，其特征在于，聚乙二醇琥珀酰
亚胺琥珀酸酐和去乙酰化透明质酸反应得到交联活性酯，所述交联活性酯与甲基纤维素交联，
形成透明质酸-甲基纤维素复合凝胶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体操作为：
(1)将预先配制好的第一份人工脑脊液加热至90℃，加入一定量的氯化钠、磷酸钠和甲
基纤维素，搅拌均匀后再加入等体积的第二份人工脑脊液，-4℃冰盐浴中搅拌40min，得到甲
基纤维素溶液，4℃冷藏过夜；
(2)将聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐配制成水溶液，加入去乙酰化透明质酸溶液中，搅
拌使溶液混合均匀，室温下反应12h，再向溶液中加入质量分数为95％的乙醇至沉淀产生完
全，过滤收集沉淀，用乙醇洗涤沉淀3次以上，真空干燥，得到交联活性酯；
(3)称取一定量的交联活性酯加入甲基纤维素溶液中，调节pH至7.4，搅拌2h以上使交
联活性酯充分分散且溶解均匀，4℃冷藏过夜，并对其冷冻干燥，得到透明质酸-甲基纤维素
复合凝胶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氯化钠、磷酸钠、甲基纤维素、去乙酰化
透明质酸的质量之比依次为(2～4)：(0～0.05)：7：1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐
水溶液的浓度为1×10-3mol/L，与去乙酰化透明质酸溶液的体积比为1：10。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐的制备
方法为：
(1)将分子量为6000的聚乙二醇，溶解于二氧六环中，以吡啶作为催化剂，加入琥珀酸
酐，加热状态下回流搅拌，反应完毕后冷却，在快速搅拌下滴加无水乙醚至沉淀不再产生，
之后置于冰浴中搅拌，过滤...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡强，高琴，卓凡露，胡堃，王颖，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11