强力霉素快速检测试剂盒及其制备、使用方法技术

本发明专利技术涉及抗生素检测技术的改进，具体涉及强力霉素快速检测试剂盒及其制备、使用方法，属于免疫学领域。强力霉素快速检测试剂盒，包括自下而上排列的支撑体、吸水层3、检测层2、带通孔1的盖板4，保藏号为：CCTCC NO:C201680杂交瘤细胞DC‑C所分泌的、胶体金标记的抗强力霉素单克隆抗体C；A液：含1‑5％分子量为20000的PEG的0.01mol/L磷酸盐缓冲液；B液：含0.01‑0.25％吐温‑20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。该试剂盒具有简便、快速、准确、灵敏的特点,最低检测浓度为2ug/ml，可用于现场对强力霉素药物残留的粗筛检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗生素检测技术的改进，具体涉及强力霉素快速检测试剂盒及其制备、使用方法，属于免疫学领域。
技术介绍
机制与四环素相同，主要是干扰敏感菌的蛋白质合成。它可以特异性地与细菌核糖体30S亚基在A位置结合，从而抑制氨基酰-tRNA在该位置上的联结，阻止肽链的延长；强力霉素还可以改变细菌细胞膜的通透性，使细胞内的核苷酸及其他重要成分漏出，从而抑制细菌DNA的复制。强力霉素对金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、化脓性链球菌、淋球菌、脑膜炎球菌、大肠杆菌、产气杆菌、志贺菌属、耶尔森菌、单核细胞李斯特菌等有较强抗菌活性，对立克次体、支原体、衣原体、放线菌等也有一定作用。抗菌谱与四环素、土霉素基本相同。体内、外抗菌力均较四环素强。强力霉素被吸收后广泛分布于各组织和体液，分布容积约为0.7L/kg。因脂溶性较高，强力霉素对组织的穿透力较强，在胸导管淋巴液、腹腔积液、肠组织、眼和前列腺组织中的药物浓度均较高，约为血药浓度的60％～75％，胆汁中的药物浓度可达血药浓度的10～20倍；在乳汁中也能达到较高的药物浓度；强力霉素也可以分布于肝脏、脾脏、骨髓、骨骼、牙本质和牙釉质中。强力霉素在体内蛋白结合率为80％～95％，清除半衰期为12～22h，肾功能减退者半衰期延长不明显。药物主要在肝脏内代谢灭活，通过肾小球滤过随尿液排泄，当肾功能损害时，强力霉素从胃肠道的排泄量增加，成为主要的代谢途径。强力霉素不能经透析清除。强力霉素目前在水产养殖行业作为一种较为普遍的抗感染药物使用，有着很好地治疗作用，但在实际生产中往往会出现强力霉素过量的情况，导致水产品及养殖水体中存在残留。根据农业部2002年12月发布的《动物性食品中兽药最高残留限量》明确规定，动物性食品肌肉中残留量为100μg/kg，皮脂中最大残留量为300μg/kg，肝脏中最大残留量为300μg/kg，肾脏中最大残留量为600μg/kg。
技术实现思路
本专利技术针对强力霉素残留的现状，以及其对人体的危害，设计专利技术提供一种能够快速、简便、准确、现场检测强力霉素的快速检测试剂盒及其制备、使用方法。本专利技术的技术方案实现如下强力霉素快速检测试剂盒，其特殊之处在于包括自下而上排列的支撑体5、用于快速吸收检测试剂的吸水层3、由硝酸纤维素膜制成的检测层2、带通孔1的盖板4；保藏号为：CCTCCNO:C201680杂交瘤细胞DC-C所分泌的、胶体金标记的抗强力霉素单克隆抗体C(简称：金标单抗C)；A液：含1-5％PEG20000、0.01-0.25％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)；B液：含0.01-0.25％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)；所述金标单抗C是由强力霉素(DC)半抗原与牛血清白蛋白(BSA)通过戊二醛法偶联合成强力霉素-牛血清白蛋白(DC-BSA)完全抗原，将其作为免疫原而制备的抗强力霉素单克隆抗体，经胶体金标记后而制；所述的胶体金标记的单克隆抗体C的制备步骤如下：1、以公知的胶体金的制备工艺制备胶体金溶液，制得的胶体金的颗粒大小为18-20nm；2、将单克隆抗体C(3g/L抗体蛋白)，按200μl-3ml加入到上述的100ml胶体金溶液中，慢搅混匀；3、向混合溶液中加入PEG20000，使其终浓度为1-5％，静置过夜；4、将其离心8000-10000转/分，1-1.5小时，弃上清；5、取离心沉淀，用含有1-5％PEG20000、0.05-0.25％吐温-20、0.02％叠氮化钠的0.01mol/L磷酸盐缓冲液悬起，制成金标单抗C；所述磷酸盐缓冲液的PH值为7.4，其中含有KCI0.2g、NaCI8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO412H2O2.9g、蒸馏水1000ml；所述步骤2中单克隆抗体C与胶体金溶液慢搅混匀30-60min；所述步骤1中所述胶体金溶液的制备方法为按一定的配比将氯金酸与柠檬酸三钠混合并加热制备成胶体金溶液；所述步骤2中单克隆抗体C与胶体金溶液慢搅混匀30-60min。强力霉素快速检测试剂盒的使用方法，其特殊之处在于包括以下步骤：1、取待测溶液5μl，点在盖板4的通孔1中的硝酸纤维素膜上，晾干；2、在其上加含1-5％PEG20000的0.01mol/LPBS的A液100μl渗入，进行封闭；3、加入100μl金标单抗C，渗入；4、加入含0.05-0.25％吐温-20的0.01mol/LPBS的B液100μl渗入；5、结果显示：硝酸纤维素膜上出现红色斑点为阳性，表示检测到有强力霉素残留；无红色斑点为阴性，表示检测不到强力霉素，或者强力霉素浓度低于2ug/ml。本专利技术强力霉素快速检测试剂盒检测原理：将待测样品滴加到硝酸纤维素膜上晾干固定，加封闭液A液封闭之后滴加金标单抗C，金标单抗C特异性和强力霉素进行结合，加洗液B液清洗之后，洗去未结合的金标抗体，利用胶体金红色颗粒显色原理呈现检测结果，在检测层硝酸纤维素膜上呈现红色斑点，表示有强力霉素残留；无红色斑点，表示无强力霉素或残留量极低。本专利技术具有以下优点：1、本专利技术的强力霉素快速检测试剂盒，从实际的养殖需要出发，将药物残留的检测搬到的养殖现场，使用时无需专门设施和操作技术，适合普通养殖户养殖现场检测，应用简单。2、具有检测快速、简便、准确、灵敏等特点，并具有较高的稳定性，在5-10min之内便可显示检测结果，一旦检出超标可以将养殖动物多养一段时间，让药物代谢直至残留低于国家标准，可以安全上市，这是最方便的一种解决药残问题的方法，减少了因药物残留对人体的伤害和养殖户因药残超标被退货造成巨大的损失，并改善因药物残留送检麻烦，周期长，收费高等原因造成99％以上养殖户在养殖动物上市前是不送检药残留的情况。3、在整个胶体金标记和试剂盒使用过程中牛血清白蛋白也可起到封闭作用，但为防止非特异性结合，均以适当浓度的、分子量为20000的PEG所代替，因免疫原种含有牛血清白蛋白，因此，用PEG代替牛血清白蛋白可杜绝因牛血清白蛋白而致的交叉反应，进一步保证了试剂盒的特异性。附图说明图1：本专利技术强力霉素快速检测试剂盒的结构示意图；图2：DC-BSA的紫外特征图谱；图3：DC的紫外特征图谱；图4：BSA的紫外特征图谱；图5：DC-BSA、BSA、DC三组图谱拟合后的紫外特征图谱；图6：OVA的紫外特征图谱；图7：DC-OVA的紫外特征图谱；图8：DC的紫外特征图谱；图9：DC-OVA，OVA，DC三组图谱拟合后的紫外特征图谱。杂交瘤细胞株DC－C，其保藏编号为：CCTCCNO：C201680；保藏单位全称及简称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；保藏单位地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心；保藏日期：2016年5月20日。具体实施方式本专利技术的实施例结合附图进一步描述如下：实施例1强力霉素完全抗原的制备：称取100mgBSA加入到10mLPBS(pH7.4)中，称取30mgDC溶于PBS中，在DC溶液缓慢搅拌下逐滴加入BSA溶液，随后缓慢滴加200μL的GA(浓度25％)，加入的同时要不断搅拌，在避光及4℃条件下反应24h，以4000rpm转速离心5min，取上清液装入提前处理好的透析袋中，PBS为透析液透析3d，每8h更换一次透析液，透析完全后本文档来自技高网...

【技术保护点】
强力霉素快速检测试剂盒，其特殊之处在于包括自下而上排列的支撑体、用于快速吸收检测试剂的吸水层(3)、由硝酸纤维素膜制成的检测层(2)、带通孔(1)的盖板(4)，保藏号为：CCTCC NO:C201680杂交瘤细胞DC‑C所分泌的、胶体金标记的抗强力霉素单克隆抗体C(简称：金标单抗C)；A液：含1‑5％分子量为20000的聚乙二醇(PEG20000)的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)；B液：含0.01‑0.25％吐温‑20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。

【技术特征摘要】
1.强力霉素快速检测试剂盒，其特殊之处在于包括自下而上排列的支撑体、用于快速吸收检测试剂的吸水层(3)、由硝酸纤维素膜制成的检测层(2)、带通孔(1)的盖板(4)，保藏号为：CCTCCNO:C201680杂交瘤细胞DC-C所分泌的、胶体金标记的抗强力霉素单克隆抗体C(简称：金标单抗C)；A液：含1-5％分子量为20000的聚乙二醇(PEG20000)的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)；B液：含0.01-0.25％吐温-20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液。2.根据权利要求1所述强力霉素快速检测试剂盒，其特征在于：所述的金标单抗C：是由小分子半抗原强力霉素(DC)与牛血清白蛋白(BSA)通过戊二醛法偶联合成的强力霉素-牛血清白蛋白(DC-BSA)完全抗原，将其作为免疫原而制备的抗强力霉素单克隆抗体，经胶体金标记后而致。3.根据权利要求1所述强力霉素快速检测试剂盒，其特征在于：所述的金标单抗C，其制备方法如下：(1)、制备胶体金溶液，制得的胶体金的颗粒大小为18-20nm；(2)、将单克隆抗体C(3g/L抗体蛋白)，按200μl-3ml加入到上述的100ml胶体金溶液中，慢搅混匀；(3)、向混合溶液中加入PEG20000，使其终浓度为1-5％，静置过夜；(4)、离心8000-10000转/分，1-1.5小时，弃上...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓洁，李楠，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：山东;37