一种荒漠拟孢囊菌和奥利万星中间体的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种荒漠拟孢囊菌和奥利万星中间体的制备方法。所述高产奥利万星中间体的菌株荒漠拟孢囊菌HS807-AN-2396(Kibdelosporangium aridum)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.10576。所述奥利万星中间体的制备方法为将所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576在发酵培养基中发酵，从发酵液中获得奥利万星中间体A82846B。该制备方法能够在60m3罐上实现奥利万星中间体发酵效价2315mg/L的高产量，有利于奥利万星的产业化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药领域，具体涉及一种荒漠拟孢囊菌和奥利万星中间体的制备方法。
技术介绍
需氧革兰阳性球菌是细菌性感染的重要病原菌，自20世纪80年代末以来，该类细菌所致感染呈持续上升的趋势。然而革兰阳性球菌耐药性的日趋严重，给感染性疾病的治疗带来严峻挑战。替考拉宁和万古霉素是目前用于治疗耐药革兰阳性菌感染的常用糖肽类药物。但是，随着临床应用的日益广泛，世界各地亦相继出现了万古霉素耐药金葡菌(VISA、VRSA)以及万古霉素耐药肠球菌(VRE)。因此，替考拉宁和万古霉素已不能完全满足临床需要，有必要开发应用新的糖肽类抗生素药物。2014年8月6日，美国FDA批准Medicines公司开发的奥利万星上市(Oritavancin，LY-333328)，商品名为Orbactiv，它是继替考拉宁和万古霉素后开发的第二代糖肽类抗生素。Orbactiv是美国FDA批准用于急性细菌性皮肤和皮肤结构感染(ABSSSIs)治疗的首个和唯一的单剂量治疗方案的抗生素。Orbactiv注射剂用于革兰阳性菌敏感株导致的ABSSSIs成人患者的治疗，包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，甲氧西林敏感和甲氧西林耐药菌株)、化脓性链球菌(Mlicrococcus scarlatinae)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)、咽峡炎链球菌群(Streptococcus anginosus、Streptococcus intermedius和Streptococcus constellatus)和粪肠球菌(Enterococcus faecalis，万古霉素敏感株)。奥利万星的化学合成需要关键中间体A82846B，其由荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)发酵产生。目前，国内外对奥利万星药物活性进行了较多研究，而对中间体A82846B的研发和生产报道少。上世纪九十
年代礼来公司获得的美国专利US5843437(授权日1998年12月1日)等对生产A82846B的菌种、发酵和提取工艺进行了描述，但其发酵效价低。而提高A82846B的发酵水平，对奥利万星产业化具有重要的应用价值。ARTP(Atmospheric and Room Temperature Plasma)为常压室温等离子体，是近几年来发展起来的一种新的等离子体源，能够在常压(1atm)下产生温度在25～40℃之间的，具有高活性粒子(如处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子、OH-自由基等)浓度的等离子体射流。研究表明，等离子体中适当剂量的活性粒子作用于微生物，能够使微生物细胞壁和细胞膜的结构及通透性改变，并引起基因损伤，进而使微生物基因序列及其代谢网络显著变化，最终导致微生物产生突变。与传统诱变方法相比，采用常压室温等离子体有效造成多样性的DNA损伤、突变率高、易获得遗传稳定性良好的突变株等优点；与分子操作手段或其他化学诱变手段相比，常压室温等离子体进行微生物诱变育种具有操作简便、成本低、无有毒有害物质参与诱变过程等优点。NTG(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)为微生物育种中常用的烷化剂，有超级诱变剂之称。烷化剂带有活性烷基，此基团能够转移到其它电子密度高的分子上去，使碱基许多位置上增加了烷基，从而在多方面改变氢键。依靠NTG诱发的突变主要是GC-AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对目前奥利万星中间体(A82846B)发酵效价低的缺陷，提供一种荒漠拟孢囊菌及其发酵获得A82846B的制备方法，所述的荒漠拟孢囊菌可以高产量生产奥利万星中间体，发酵效率高；所述的制备方法可以以较低成本获得大量的奥利万星中间体，有利于产业化生产。本专利技术所述的A82846B的结构式如式(1)所示：本专利技术人把ARTP和NTG这两种物理和化学的诱变手段结合起来进行复合诱变筛选，获得了发酵效价高、遗传性状稳定的产A82846B的突变的荒漠拟孢囊菌。并对荒漠拟孢囊菌发酵获得A82846B的方法的发酵培养基配方、工艺参数等进行优化。本专利技术的技术方案之一是：一种荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.10576。从海地土壤样品中分离获得菌种A.orientalis A82846，经自然分离得到的菌株HS807-O-13，菌株HS807-O-13经诱变筛选后得到菌株HS807-A-639，所述菌株HS807-A-639经ARTP和NTG复合诱变筛选，获得具有高产A82846B的菌株CGMCC No.10576。对该菌株进行鉴定，结果为荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)，命名为HS807-AN-2396。该菌株已于2015年3月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并收到保藏中心登记入册编号CGMCC No.10576，其具有以下的微生物学特性：1、形态学的特性在显微镜下观察在固体培养基中培养的菌株时，该菌呈长短不一的丝状，菌丝直径为0.1-1.0μm，产白色孢子，革兰氏染色呈阳性。2、培养学的特性当在温度14～37℃、pH5.0～7.5下，菌落生长良好，超过该范围则会出现生长差或不生长的情况。3、生理特性可以很好地利用D-葡萄糖、麦芽糖、D-乳糖作为碳源，但不利用D-木糖、L-阿拉伯糖和甘氨酸。可以有效地利用铵盐类氮源；但是难以利用硝酸盐类氮源。可以在除腺嘌呤以外的降解物上生长良好；在降解方面，仅能够降解酪蛋白和酪氨酸。并且能够进行明胶液化并能够产生硫化氢。本专利技术的技术方案之二是：一种制备奥利万星中间体A82846B的方法，将所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576在发酵培养基发酵，从发酵液中获得奥利万星中间体A82846B。本专利技术所述发酵的时间为本领域常规的时间，较佳地为168～240小时，更佳地为192～212小时，最佳地为202～210小时。本专利技术所述发酵的温度为本领域常规的温度，较佳地为25～34℃，更佳地为28～32℃。所述发酵在摇瓶中进行，所述摇瓶的体积为本领域常规的体积，较佳地为250mL。转速为本领域常规的转速，较佳地为250rpm。所述振幅为本领域常规的振幅，较佳地为5cm。所述发酵的湿度为本领域常规的湿度，较佳地为40～60％。所述发酵在小试发酵罐中进行，所述小试发酵罐的体积为本领域常规的体积，较佳地为50L。搅拌转速为本领域常规的转速，较佳地为200～600rpm。溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为30～50％，所述的百分比为本领域常规，较佳地为发酵罐中发酵液的含氧量占该温度下饱和含氧量的百分比。空气流量为本领域常规的空气流量，较佳地为0.5～1.0vvm。所述发酵在中试发酵罐中进行，所述中试发酵罐的体积为本领域常规的体积，较佳地为5000L。搅拌转速为本领域常规的转速，较佳地为30～150rpm。
溶氧量为本领域常规的溶氧量，较佳地为30～40％，所述的百分比为本领域常规，较佳地为发酵罐中发酵液的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)，其特征在于，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.10576。

【技术特征摘要】
1.一种荒漠拟孢囊菌(Kibdelosporangium aridum)，其特征在于，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.10576。2.一种制备奥利万星中间体A82846B的方法，其特征在于，将如权利要求1所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576在发酵培养基中发酵，从发酵液中获得奥利万星中间体A82846B。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵的时间为168～240小时，较佳地为192～212小时，更佳地为202～210小时；和/或，所述发酵的温度为25～34℃，较佳地为28～32℃。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵在摇瓶中进行，转速为250rpm；振幅为5cm；和/或，所述发酵的湿度为40～60％。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵在小试发酵罐中进行；搅拌转速为200～600rpm；溶氧量为30～50％；和/或，空气流量为0.5～1.0vvm。6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵在中试发酵罐中进行，搅拌转速为30～150rpm；溶氧量为30～40％；和/或，空气流量为0.2～1.0vvm。7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵在产业化发酵罐中进行，搅拌转速为30～120rpm；溶氧量为30～35％；和/或，空气流量为0.1～0.8vvm。8.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵的种子液的接种量为10～12％，所述的百分比为体积百分比；所述发酵的种子液由包括如下的步骤的方法获得：将如权利要求1所述的荒漠拟孢囊菌CGMCC No.10576在种子培养基中培养。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述培养的时间为37～44小时，较佳地为41～43小时；和/或，所述培养的温度为28～32℃。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养在摇瓶中进行，
\t转速为250rpm；振幅为5cm；和/或，所述发酵的湿度为40～60％。11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养在小试种子罐中进行，搅拌转速为200～600rpm；所述小试发酵罐的溶氧量为30～50％；和/或，空气流量为0.5～1.5vvm。12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养在中试种子罐中进行，搅拌转速为30～150rpm；溶氧量为30～40％；和/或，空气流量为0.2～1.0vvm。13.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述培养在产业化种子罐中进行，搅拌转速为50～200rpm；溶氧量为30～50％；和/或，空气流量为0.2～1.0vvm。14.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的种子培养基包括如下的组成成分(g/L)：葡萄糖5.0～15.0、可溶性淀粉10.0～30.0、黄豆饼粉10.0～30.0、酵母抽提粉2.0～8.0、水解酪蛋白2.0～8.0、氯化钠0.1～0.5和碳酸钙0.9～1.5，pH6.8～7.5；更佳地包括如下的组成...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑玲辉，洪云，邱海潇，徐长安，陈峰，熊正军，白骅，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33