一种蓝色犁头霉及其应用技术制造技术

本发明专利技术公开了一种高产甾体发酵蓝色犁头霉（Absidia coerulea）新菌株LJYHL20130405‑3及其在以甾体中间体RSA为底物生产氢化可的松中的应用。所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏时间为2013年6月8日，保藏号为：CGMCC No.7688。本发明专利技术所述的蓝色犁头霉菌株，其用于甾体化合物（薯蓣皂甙）为原料生产植物激素的转化过程中，以甾体中间体RSA（17α‑hydroxypregn‑4‑en‑3,20‑dione‑21‑acetate）为底物生产氢化可的松（Hydrocortisone）。其生产氢化可的松具有转化率高（68～72%）、收率高（48～50%），而且生物学性状比较稳定等特点。本发明专利技术可以为以薯蓣皂甙为原料的植物甾体激素生产提高产量、降低生产成本提供技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于工业真菌
，具体设计一种高产甾体发酵蓝色犁头霉菌株及其甾体化合物发酵的应用技术。
技术介绍
1甾体化合物C11β-羟化微生物发酵甾体化合物是一类含有环戊烷多氢菲核的化合物，由于母核上取代基、双键位置或立体构型的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。与甾体化合物有关的激素类药物主要为：肾上腺皮质激素(Adrenocorticosteroids)、性激素(Sex Hormone)、蛋白同化激素(Anabolic steroids)。氢化可的松(hydrocortisone，HC)是人工合成也是天然存在的糖皮质激素，抗炎作用为可的松的1.25倍，具有免疫抑制作用、抗毒作用、抗休克及一定的盐皮质激素活性等，并有留水、留钠及排钾作用。1948年，美国风湿病专家Hench在风湿病关节炎的治疗中发现可的松在体内转化HC才具有疗效。因 发 现 可 的 松 和HC的药理作用，Hench、Reichstein和Kendal一起获得了1950年的诺贝尔奖，并从此掀起了开发皮质激素的高潮。Wendler等用化学法合成了HC，但由于步骤多、收率低 ，导致药品价格昂贵而难以工业化。此后，人们开始把目光转向生物转化方法。Fieser首先采用微生物转化方法使HC工业化生产成为可能。为提高转化率和收率，国内外研究人员做出了不懈努力，并取得较大进展。由于在甾体C11位周围没有活性功能基团的影响，常规化学法很难氧化非活泼碳氢键，而生物催化法却能对它立体选择性氧化。有效的菌种是黑根霉和犁头霉。前者可专一性的在C11位引入α-羟基，引入构型恰恰相反，故还需将其氧化为酮得醋酸可的松，再用钾硼氢对其进行不对称还原，得C11位β-羟基物，即HC；犁头霉却能在化合物S（RSA）的C11位上直接引入β-羟基，后者就缩短了合成HC的工艺路线。羟化反应是甾体微生物转化反应中最重要和最广泛被应用的反应：一方面，羟基化能够为进一步的化学合成提供中间体；另一方面，用微生物进行羟基化反应可以达到一般化学反应达不到的部位，并羟基化后的甾体化合物具有消炎等方面的活性。C11羟基对于甾体化合物抗炎的活性是必不可少的。甾体的微生物羟化反应是利用微生物内的羟化酶对甾体特定部位引入羟基，由于羟化酶的不稳定性，在提取过程中极易失活，因此通常采用微生物菌体细胞转化。转化过程通常分两个阶段。第一阶段是菌体的培养，第二阶段是加入甾体底物进行转化。由于甾体化合物的疏水性，在底物浓度较高时，产物在发酵液中呈结晶析出，属于拟结晶发酵。目前国内生产HC的菌种主要是蓝色犁头霉（AbsidiacoeruleaBainier），但由于蓝色犁头霉氧化专一性低，HC的收率受到限制。国外大都是用新月弯孢霉进行工业化生产，国内对用新月弯孢霉进行生物转化生产HC也有相关研究，但工业化生产较少。因此选育出具有转化率和得率较高、性状稳定的蓝色犁头霉菌种，对我国甾体微生物发酵具有重大意义。2犁头霉属分类地位及利用现状犁头霉属（AbsidiaTiegh）属于真菌界（Fungi）、接合菌门（Zygomycota）、毛霉目（Mucorales）、小克银汉霉科（Cunninghamellaceae）。这个属报道了79个种和种下分类单元，都为土壤生真菌。最近根据生理学、分子生物学和形态学研究，犁头霉属被分为3组：嗜温的，耐温的和生长缓慢的寄生性种类。其中耐温的种类已经从犁头霉属种分出去，成立了一个新科：Mycocladiaceae。该科目前仅一个属，即Mycocladus。蓝色犁头霉（A. coerulea Bainier）仍然保留在犁头霉属中。
技术实现思路
本专利技术目的之一是提供一种蓝色犁头霉新菌株，其用于甾体化合物（薯蓣皂甙）为原料生产植物激素的转化过程中，以甾体中间体为底物生产氢化可的松具有转化率高、收率高的特点。本专利技术目的之二是提供上述蓝色犁头霉新菌株，将甾体中间体RSA作为底物，将其转化为氢化可的松产物中的应用。本专利技术目的之三是提供上述蓝色犁头霉新菌株在以甾体中间体RSA为底物生产氢化可的松的专用方法。实现本专利技术上述目的采取的技术方案是：所述蓝色犁头霉菌株属于真菌界、接合菌门、毛霉目、小克银汉霉科，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”（保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类名：蓝色犁头霉，Absidia coerulea），保藏时间为2013年6月8日，保藏号为：CGMCC No.7688。所述蓝色犁头霉菌株可应用于以甾体中间体RSA为底物制备氢化可的松产物中。所述的蓝色犁头霉菌株在以甾体中间体RSA为底物生产氢化可的松的方法包括以下步骤：⑴原种复活：在菌种生长温度条件下，将保存的原种在PDA培养基茄子瓶或者克氏瓶斜面上培养，直到气生菌丝长满斜面；⑵制备菌悬液：取无菌水倒入培养好菌种的茄子瓶中，用接种针搅拌完全，再取菌悬液稀释后，涂布在PDA平板上，在菌种生长温度条件下培养；⑶制备茄子瓶或者克氏瓶斜面：在培养的PDA平板上选择单个菌落接种在PDA茄子瓶或者克氏瓶斜面上，在菌种生长温度条件下培养；⑷制备一级种子液：在培养好的茄子瓶或克氏瓶斜面菌种中加入无菌水制备菌悬液并移入已经灭菌的摇瓶培养液中，在菌种生长温度条件下，在摇床上培养，pH到4.5以下获得一级种子液；⑸制备二级种子液：培养基以及装量与上一步相同，将一级种子液按照20%移种量移入二级摇瓶培养，在菌种生长温度条件下，在摇床上培养，pH到3.5以下即得二级种子液；⑹投料发酵：按照0.2wt%的投料量投入RSA酒精溶液到二级种子液中摇瓶发酵培养得到发酵液；⑺结果检测：将每个摇瓶的发酵液经抽滤后，取滤液加入等量醋酸丁酯进行萃取并浓缩结晶。将结晶物抽滤得到氢化可的松粗品和母液，将氢化可的松粗品烘干称取粗品重量，根据投料量计算粗品收率和转化率；⑻选取生产菌株：在收率80%以上、转化率70%以上的菌株中选择收率和转化率高于平均值的菌株，一方面制成砂土管原种或者牛奶冻干管在4℃条件下保存于冰箱中作为原种为以后生产和选育优良菌株备用，另一方面传代用于甾体发酵生产；⑼传代培养：在菌种生长温度条件下，将选取的生产菌株接入PDA培养基茄子瓶斜面上培养，直到气生菌丝长满斜面；⑽培养生产母种：将传代培养后的菌种从茄子瓶斜面上接入PDA培养基克氏瓶斜面上培养，在菌种生长温度条件下培养，使得气生菌丝长满克氏瓶并呈蓝黑色；⑾培养一级生产种子液：将生产母种接入种子罐中，培养基与摇瓶培养液相同，在菌种生长温度条件下培养，取样镜检确定没有被污染并且PH到4.5以下，菌丝体体积达到85%以上标准后即可移入二级发酵罐中培养；⑿底物溶液制备：溶解罐中投入RSA，加入水和酒精，密闭后升温回流至RSA溶清，溶液清亮透明，然后保温备用；⒀培养二级生产种子液：在发酵罐中置入培养液，然后将种子罐中的一级生产种子液移入该发酵罐，在菌种生长温度条件下培养培养后，取样镜检确定没有被污染并且pH到3.5以下，菌丝体体积在40%～60%之间，降温并加片碱水溶液压入底物溶液；⒁投底物发酵：压入RSA底物溶液，在菌种生长温度下发酵培养，根据取样检测当时的发酵罐中的转化情况决定发酵终止时间；⒂压滤：在发酵达到终止条件后加硫酸水溶液调节pH至5.4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蓝色犁头霉菌株，属于真菌界、接合菌门、毛霉目、小克银汉霉科，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏时间为2013年6月8日，保藏号为：CGMCC No.7688。

【技术特征摘要】
1.一种蓝色犁头霉菌株，属于真菌界、接合菌门、毛霉目、小克银汉霉科，保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏时间为2013年6月8日，保藏号为：CGMCC No.7688。2.一种权利要求1所述的蓝色犁头霉菌株在以甾体中间体RSA为底物制备氢化可的松产物中的应用。3.一种权利要求1所述的蓝色犁头霉菌株在以甾体中间体RSA为底物生产氢化可的松的方法，其特征在于包括以下步骤：⑴原种复活：在菌种生长温度条件下，将保存的原种在PDA培养基茄子瓶或者克氏瓶斜面上培养，直到气生菌丝长满斜面；⑵制备菌悬液：取无菌水倒入培养好菌种的茄子瓶中，用接种针搅拌完全，再取菌悬液稀释后，涂布在PDA平板上，在菌种生长温度条件下培养；⑶制备茄子瓶或者克氏瓶斜面：在培养的PDA平板上选择单个菌落接种在PDA茄子瓶或者克氏瓶斜面上，在菌种生长温度条件下培养；⑷制备一级种子液：在培养好的茄子瓶或克氏瓶斜面菌种中加入无菌水制备菌悬液并移入已经灭菌的摇瓶培养液中，在菌种生长温度条件下，在摇床上培养，pH到4.5以下获得一级种子液；⑸制备二级种子液：培养基以及装量与上一步相同，将一级种子液按照20%移种量移入二级摇瓶培养，在菌种生长温度条件下，在摇床上培养，pH到3.5以下即得二级种子液；⑹投料发酵：按照0.2wt%的投料量投入RSA酒精溶液到二级种子液中摇瓶发酵培养得到发酵液；⑺结果检测：将每个摇瓶的发酵液经抽滤后，取滤液加入等量醋酸丁酯进行萃取并浓缩结晶，将结晶物抽滤得到氢化可的松粗品和母液，将氢化可的松粗品烘干称取粗品重量，根据投料量计算粗品收率和转化率；⑻选取生产菌株：在收率80%以上、转化率70%以上的菌株中选择收率和转化率高于平均值的菌株，一方面制成砂土管原种或者牛奶冻干管在4℃条件下保存于冰箱中作为原种为以后生产和选育优良菌株备用，另一方面传代用于甾体发酵生产；⑼传代培养：在菌种生长温度条件下，将选取的生产菌株接入PDA培养基茄子瓶斜面上培养，直到气生菌丝长满斜面；⑽培养生产母种：将传代培养后的菌种从茄子瓶斜面上接入PDA培养基克氏瓶斜面上培养，在菌种生长温度条件下培养，使得气生菌丝长满克氏瓶并呈蓝黑色；⑾培养一级生产种子液：将生产母种接入种子罐中，培养基与摇瓶培养液相同，在菌种生长温度条件下培养，取样镜检确定没有被污染并且PH到4.5以下，菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：周德群，杨晓亮，王钱钢，赵月华，
申请(专利权)人：丽江映华生物药业有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53