本发明专利技术公开一种大鲵活性肽及用途，是以大鲵肉为原料，通过海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶进行酶解，酶解产物通过胰蛋白酶固定超滤膜分离器进行分离，再通过Sephadex LH‑20分子筛层析、高效液相色谱分离纯化后得到的大鲵活性肽。该大鲵活性肽即能够有效清除自由基、提高机体免疫力，同时还能够促进皮肤纤维原细胞增殖，在食品、医药和化妆品领域中有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于大鲵制品，尤其是涉及一种同时具备可清除自由基、提高机体免疫力以及促皮肤纤维原细胞生长作用的大鲵活性肽及用途。
技术介绍
研究表明，大鲵的肌肉、皮肤、内脏、脂肪、血液等含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪酸及微量元素等，对大鲵蛋白质进行深加工，可以获得一系列益于人类生命活动的大鲵生物活性肽，是保健食品及药品的潜在来源。目前，大鲵生物活性肽大多是以大鲵的肌肉、皮肤、内脏、脂肪、血液为原料，通过酶解、分离等技术制备而成，但是不同部位的原料，以及使用不同的酶和酶解时间、采用不同的分离技术，可以得到具有不同功能的活性肽，但大多功能单一。迄今为止，还没有关于同时具备可清除自由基、提高机体免疫力以及促皮肤纤维原细胞生长作用的大鲵活性肽的相关报道。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种同时具备可清除自由基、提高机体免疫力以及促皮肤纤维原细胞生长作用的大鲵活性肽及用途。本专利技术的技术解决方案是：一种大鲵活性肽，其特征在于按照如下步骤制备：a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入1~3倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；b. 离心取上清，采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；c. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱，按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥；d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10~50mg/ml的去离子水溶液，8000 rpm、4℃条件下离心10 min，用0.22 µm水膜过滤，得到上样上清液；e. 使用ddH2O 配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A，使用ddH2O 配制95%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0~20min，流动相A100%；20.5~40min，流动相A50%，流动相B50%；40.5~60min, 流动相B100%；将上液上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口，收集紫外检测波长280 nm的吸收峰；f. 挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到大鲵肽制品。一种上述的大鲵活性肽在制备清除自由基产品中的应用。一种上述的大鲵活性肽在制备提高机体免疫力产品中的应用。一种上述的大鲵活性肽在制备促进皮肤纤维原细胞增殖产品中的应用。本专利技术是以大鲵肉为原料，通过海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶进行酶解，酶解产物通过胰蛋白酶固定超滤膜分离器进行分离，再通过Sephadex LH-20分子筛层析、高效液相色谱分离纯化后得到的大鲵活性肽。该大鲵活性肽即能够有效清除自由基、提高机体免疫力，同时还能够促进皮肤纤维原细胞增殖，在食品、医药和化妆品领域中有广阔的应用前景。附图说明图1是本专利技术实施例Sephadex LH-20分子筛层析图。图2是本专利技术实施例的高效液相色谱图。图3是本专利技术实施例大鲵活性肽的一级质谱图。图4至图11是本专利技术实施例大鲵活性肽的二级质谱图。图12是本专利技术实施例大鲵活性肽清除DPPH自由基的能力示意图。图13是本专利技术实施例大鲵活性肽清除ABTS自由基的能力示意图。图14是本专利技术实施例大鲵活性肽提高小鼠脾细胞中的IgG值验结果图。图15是本专利技术实施例大鲵活性肽对小鼠吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数结果图。图16是本专利技术实施例大鲵活性肽对小鼠T淋巴细胞ANAE染色数结果图。图17是本专利技术实施例大鲵活性肽对小鼠皮肤的纤维原细胞的影响示意图。具体实施方式实施例1：按照如下步骤进行：a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入1倍体积pH 7的0.01M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.1%的复合酶，酶解12 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；b. 离心取上清，采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；c. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱（15mm×1000mm），按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥，如图1所示：所收集的层析产物是OD280nm的吸收峰（峰II）；d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10mg/ml的去离子水溶液，8000 rpm、4℃条件下离心10 min，用0.22 µm水膜过滤，得到上样上清液；e. 使用ddH2O 配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A，使用ddH2O 配制95%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0~20min，流动相A100%；20.5~40min，流动相A50%，流动相B50%；40.5~60min, 流动相B100%；将上液上清液注入C18柱P230型高效液相色谱仪进样口，收集UV230紫外检测波长280 nm的吸收峰；f. 在通风厨挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到大鲵肽制品。实施例2：按照如下步骤进行：a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入3倍体积pH 8的0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为1%的复合酶，酶解48 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；b. 离心取上清，采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；c. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱（15mm×1000mm），按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥，如图1所示：所收集的层析产物是OD280nm的吸收峰（峰II）；d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10mg/ml的去离子水溶液，8000 rpm、4℃条件下离心10 min，用0.22 µm水膜过滤，得到上样上清液；e. 使用ddH2O 配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A，使用ddH2O 配制95%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0~20min，流动相A100%；20.5~40min，流动相A50%，流动相B50%；40.5~60min, 流动相B100%；将上液上清液注入C18柱P230型高效液相色谱仪进样口，收集UV230紫外检测波长280 nm的吸收峰；f. 在通风厨挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到大鲵肽制品。实施例3：按照如下步骤进行：a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入2倍体积pH 8的0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.5%的复合酶，酶解34 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；b. 离心取本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种大鲵活性肽，其特征在于按照如下步骤制备：a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入1~3倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；b. 离心取上清，采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；c. 通过Sephadex LH‑20分子筛层析柱，按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥；d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10~50mg/ml的去离子水溶液，8000 rpm、4℃条件下离心10 min，用0.22 µm水膜过滤，得到上样上清液；e. 使用ddH2O 配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A，使用ddH2O 配制95%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0~20min，流动相A100%；20.5~40min，流动相A50%，流动相B50%；40.5~60min, 流动相B100%；将上液上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口，收集紫外检测波长280 nm的吸收峰；f. 挥发收集物中的甲醇后真空冷冻干燥，得到大鲵肽制品。...
【技术特征摘要】
1.一种大鲵活性肽，其特征在于按照如下步骤制备：a. 将大鲵肉匀浆，向匀浆中加入1~3倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆重量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48 h；所述复合酶为海洋碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶按活力单位比为7:3比例混合；b. 离心取上清，采用截留分子量为4000 Da以下用物理吸附法制备的胰蛋白酶固定超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；c. 通过Sephadex LH-20分子筛层析柱，按每管1ml收集层析产物，取第30~36管层析产物进行冷冻干燥；d．将c步骤所得到的冷冻干燥物制备成10~50mg/ml的去离子水溶液，8000 rpm、4℃条件下离心10 min，用0.22 µm水膜过滤，得到上样上清液；e. 使用ddH2O 配制5%甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45 µm水膜...
【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，佟长青，
申请(专利权)人：张家界中国金驰大鲵生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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