从大鲵皮或黏液中提取玻尿酸的方法技术

本发明专利技术公开一种从大鲵皮或黏液中提取玻尿酸的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：将大鲵皮或/和大鲵黏液在0~10℃进行匀浆；向匀浆中加入5~10倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆质量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48 h；所述复合酶为3500 u/mg的链霉蛋白酶、6000u/mg的木瓜蛋白酶和6000 u/mg的胰蛋白酶按活力单位比为1：5：5比例混合；将酶解后的酶解液pH调为4~5，静置12h，6000rpm离心20 min，收集上清液；将上清液通过截留分子量为50000 Da的超滤膜进行分离，取超滤膜截留的液体；按体积比1：1.5~3比例加质量浓度95%乙醇，收集沉淀，冷冻干燥，得到玻尿酸。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种玻尿酸的制备方法，尤其是一种制备工艺简单、得率及纯度高、质量好的从大鲵皮或黏液中提取玻尿酸的方法。技术背景玻尿酸即透明质酸（Hyaluronicacid,HA），是一种高分子直链多糖，由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸二糖单位重复结构组成，广泛分布于人体及动物的结缔组织中，不同来源的玻尿酸结构完全相同，仅在相对分子量大小上存在差异。研究表明，玻尿酸具有高度弹性、可塑性、渗透性和良好的生物相容性，作为一种可吸收、可降解的生物材料，已在药物、化妆品等领域有着广泛的应用。如玻尿酸理论保水值可高达800ml/g，可以作为天然保湿因子；玻尿酸作为药物应用于眼科晶体植入、角膜移植、抗青光眼手术以及治疗关节炎中。目前，玻尿酸的主要来源有两种：一种是从鸡冠、人脐带、动物眼球及猪皮等动物组织中提取；另一种是以发酵的方法从链球菌属微生物中获得。如陆文雄1999年发表了《猪皮透明质酸的制备研究》，是以中性蛋白酶对猪皮进行酶解以获得玻尿酸，虽然得率等相对其它技术有所提高，但也只能达到0.14%。由于受原料及得率的限制，每年产量不足2000kg，远远不能满足市场需求。上世纪90年代以来，湖南、湖北、陕西及广西都建立了大量的大鲵驯养繁殖企业，目前全国大鲵养殖规模已有500~600万尾。大鲵体表无鳞，多皮肤腺，在生长过程中不断分泌内含多种活性物质的黏液。但是，迄今为止，还没有关于从大鲵皮或黏液中提取玻尿酸的相关报道。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种制备工艺简单、得率及纯度高、质量好的从大鲵皮或黏液中提取玻尿酸的方法。本专利技术的技术解决方案是：一种从大鲵皮或黏液中提取玻尿酸的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.将大鲵皮或/和大鲵黏液在0~10℃进行匀浆；b.向匀浆中加入5~10倍体积pH7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆质量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48h；所述复合酶为3500u/mg的链霉蛋白酶、6000u/mg的木瓜蛋白酶和6000u/mg的胰蛋白酶按活力单位比为1：5：5比例混合；将酶解后的酶解液pH调为4~5，静置12h，6000rpm离心20min，收集上清液；c.将上清液通过截留分子量为50000Da的超滤膜进行分离，取超滤膜截留的液体；按体积比1：1.5~3比例加质量浓度95%乙醇，收集沉淀，冷冻干燥，得到玻尿酸。本专利技术是采用三种酶按比例配制成复合蛋白酶对大鲵皮或大鲵黏液匀浆进行酶解，各种酶相互作用，可使玻尿酸与蛋白质交织结构在常温下（20~30℃）酶解分离，使收集的上清液中含有浓度较高的玻尿酸，经过截留分子量50kDa的超滤膜过滤去除酶解液中的酶及酶解产物，并以乙醇沉淀，即可得到纯度≥96%（质量百分比）的玻尿酸，得率可达1%（质量百分比），制备工艺简单，成本低，所制备的玻尿酸相对分子量为1.2×106Da，，可应用于化妆品、药品等领域。具体实施方式实施例1：a.将大鲵皮5kg在0~10℃进行匀浆；b.向匀浆中加入20LpH7~8的0.05M磷酸缓冲液及50g的复合酶，酶解30h；所述复合酶为将链霉蛋白酶（3500u/mg）、木瓜蛋白酶（6000u/mg）和胰蛋白酶（6000u/mg）按活力单位比为1：5：5比例混合；用食用级盐酸将酶解后的酶解液pH调为5，静置12h，6000rpm离心20min，收集上清液13.5L；c.将上清液通过截留分子量为50000Da的超滤膜进行分离，取超滤膜截留的液体共5L；加质量浓度95%乙醇沉淀，收集沉淀，冷冻干燥，得到51g干燥产物。用陆文雄报道的Bitter-Muir咔唑法以及Elson-Morgan法分别对干燥产物中的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖含量进行检测，发现D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖含量摩尔比为1:1，各自含量达到总质量的43%及49%，其中仅含有质量百分比0.07%的蛋白质，且采用特性粘度法测得所制备的玻尿酸（干燥产物）相对分子量较高，为1.2×106Da。将实施例1的检测结果与陆文雄1999年发表的《猪皮透明质酸的制备研究》中的检测结果对比见表1，可以看出采用本专利技术的方法生产的玻尿酸收率、纯度及质量均远高于对比例。表1：实施例1检测结果与对比例对比蛋白质含量（%）D-葡萄糖醛酸（%）分子量收率（%）对比例<0.1140.29.5×105Da0.14实施例10.0743.01.2×106Da1.00实施例2：a.将大鲵粘液5kg在0~10℃进行匀浆；b.向匀浆中加入30LpH7~8的0.1M磷酸缓冲液及50g的复合酶，酶解40h；所述复合酶为将链霉蛋白酶（3500u/mg）、木瓜蛋白酶（6000u/mg）和胰蛋白酶（6000u/mg）按活力单位比为1：5：5比例混合；用食用级盐酸将酶解后的酶解液pH调为4，静置12h，6000rpm离心20min，收集上清液14.5L；c.将上清液通过截留分子量为50000Da的超滤膜进行分离，取超滤膜截留的液体共5.1L；加质量浓度95%乙醇沉淀，收集沉淀，冷冻干燥，得到52g干燥产物。用陆文雄报道的Bitter-Muir咔唑法以及Elson-Morgan法分别对干燥产物中的D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖含量进行检测，发现D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖含量摩尔比为1:1，各自含量达到总质量的42.8%及48.7%，其中仅含有质量百分比0.06%的蛋白质，且采用特性粘度法测得所制备的玻尿酸（干燥产物）相对分子量较高，为1.2×106Da。将实施例2的检测结果与陆文雄1999年发表的《猪皮透明质酸的制备研究》中的检测结果对比见表2，可以看出采用本专利技术的方法生产的玻尿酸收率、纯度及质量均远高于对比例。表2：实施例2检测结果与对比例对比蛋白质含量（%）D-葡萄糖醛酸（%）分子量收率（%）对比例<0.1140.29.5×105Da0.14实施例10.0642.81.2×106Da1.00按照一条成年大鲵每年可提取大鲵黏液500g计算，可制取玻尿酸5g，以500~600万尾成年大鲵计算，可制备玻尿酸25000kg，极大缓解了市场供需矛盾。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从大鲵皮或黏液中提取玻尿酸的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a. 将大鲵皮或/和大鲵黏液在0~10℃进行匀浆；b. 向匀浆中加入5~10倍体积pH 7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆质量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48 h；所述复合酶为3500 u/mg的链霉蛋白酶、6000u/mg的木瓜蛋白酶和6000 u/mg的胰蛋白酶按活力单位比为1：5：5比例混合；将酶解后的酶解液pH调为4~5，静置12h，6000rpm离心20 min，收集上清液；c. 将上清液通过截留分子量为50000 Da的超滤膜进行分离，取超滤膜截留的液体；按体积比1：1.5~3比例加质量浓度95%乙醇，收集沉淀，冷冻干燥，得到玻尿酸。

【技术特征摘要】
1.一种从大鲵皮或黏液中提取玻尿酸的方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：a.将大鲵皮或/和大鲵黏液在0~10℃进行匀浆；b.向匀浆中加入5~10倍体积pH7~8的0.01~0.1M磷酸缓冲液及与匀浆质量比为0.1~1%的复合酶，酶解12~48h；所述复合酶为3500u/mg的链霉蛋白酶、6000u/mg的木...

【专利技术属性】
技术研发人员：李伟，佟长青，
申请(专利权)人：张家界中国金驰大鲵生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43