【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于人类慢性疾病动物模型
,涉及一种人类慢性疾病动物模型的建立方法,尤其是一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法及应用和该构建方法的筛选方法。
技术介绍
随着人们生活水平的改善和饮食结构的改变,近年来,高尿酸血症的发病率在世界范围内都有显著上升趋势。高尿酸血症自身不仅给人类的健康带来很大的威胁,还会产生各种并发症,如心脑血管疾病和动脉粥样硬化等。因此加强对高尿酸血症的防控及相关药物的研发已成为一项紧迫任务。但现有高尿酸血症动物模型的不足已成为高尿酸血症病理研究和新药研发的主要障碍。因此,建立科学、合理、相似性高、重复性好、可靠性强和可控易行的高尿酸血症动物模型具有重要的现实意义。建立高尿酸血症动物模型,是筛选安全、高效的降尿酸药物的前提和基础。目前,已经建立的高尿酸血症模型的动物主要有小鼠、大鼠、鸡、鹌鹑等。大鼠、小鼠一方面是实验室的常用动物,操作、饲养都较为方便,与人类种属差异小。但另一方面,小鼠、大鼠的尿酸的代谢途径与人类大为不同,存在尿酸酶,而人类没有,使得造模有一定的不确定性而受到限制。鸡和鹌鹑,尿酸合成和代谢与人类极为相似,体内无尿酸酶,不能将尿酸氧化,但与人类不同属,且普通实验室饲养也不方便。另外,在建立高尿酸血症模型时,不同的给药方式也会产生很大的影响。目前建立模型的给药方式上主要有五种:饲喂、灌胃、腹腔注射、皮下注射及基因敲除。禽类以饲喂给药,大鼠及小鼠前四种方式均可造模,基因敲除研究仅限于小鼠。不同的给药方式各有优缺点:饲喂动物进食量的不均会使体内血尿酸水平不稳定,但持续时间较长;灌胃可以避免血尿酸水平不稳定;注射给药操作 ...
【技术保护点】
一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法,其特征在于:步骤如下:利用秀丽隐杆线虫,采用前体物质黄嘌呤、终浓度为0.25‑0.45mg/mL、液体给药,20‑25℃条件下培养18‑32h,即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。
【技术特征摘要】
1.一种秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法,其特征在于:步骤如下:利用秀丽隐杆线虫,采用前体物质黄嘌呤、终浓度为0.25-0.45mg/mL、液体给药,20-25℃条件下培养18-32h,即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。2.根据权利要求1所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法,其特征在于:步骤如下:利用秀丽隐杆线虫,采用前体物质黄嘌呤、终浓度为0.25mg/mL、液体给药,20℃条件下培养18h,即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。3.如权利要求1或2所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法在降尿酸药物筛选中的应用。4.如权利要求1或2所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法所构建的秀丽隐杆线虫高尿酸模型在降尿酸药物筛选中的应用。5.如权利要求1或2所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法,其特征在于:步骤如下:⑴利用高效液相色谱法测定秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量;⑵对步骤⑴的秀丽隐杆线虫分别采用固体给药和液体给药两种方式进行培养,通过比较两种给药方式对秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的影响,确定最佳的给药培养方式;⑶对步骤⑵所确定的最佳给药方式分别给予秀丽隐杆线虫次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤四种药物不同的浓度和不同的作用时间,以秀丽隐杆线虫为单位,测定秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化,确定最佳的给药物质、给药剂量;所述不同的浓度为0,0.05,0.15,0.25,0.50,0.65mg/mL;所述不同的作用时间为0,6,10,18,24,32,48h;⑷在步骤⑶所确定的最佳给药物质和给药剂量条件下,测定最佳给药物质在不同给药时间对秀丽隐杆线虫平均寿命的影响并结合秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化,确定最佳给药物质的最佳给药时间;所述不同给药时间为0,18,24,32,48h;⑸确立秀丽隐杆线虫高尿酸模型构建方法,对由该构建方法所获得的高尿酸秀丽隐杆线虫模型进行系列实验评价,所述系列实验评价包括秀丽隐杆线虫运动能力变化评价、秀丽隐杆线虫产卵量变化评价、模型稳定性评价、别嘌呤醇药物评价、黄嘌呤氧化酶活性评价,确定高尿酸秀丽隐杆线虫模型构建方法的稳定性、可靠性以及对秀丽隐杆线虫的损伤性,确定最佳条件,即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。6.根据权利要求5所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法,其特征在于:步骤如下:⑴利用高效液相色谱法测定400-1000条秀丽隐杆线虫体内的尿酸含量;⑵对步骤⑴的秀丽隐杆线虫分别采用固体给药和液体给药两种方式进行培养,通过比较两种给药方式对秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的影响,确定最佳的给药培养方式,为液体给药;⑶对步骤⑵所确定的最佳给药方式分别给予秀丽隐杆线虫次黄嘌呤、尿酸、黄嘌呤和腺嘌呤四种药物不同的浓度和不同的作用时间,以400-1000条秀丽隐杆线虫为单位,测定秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化,确定最佳的给药物质、给药剂量,为黄嘌呤终浓度0.25mg/mL;所述不同的浓度为0,0.05,0.15,0.25,0.50,0.65mg/mL;所述不同的作用时间为0,6,10,18,24,32,48h;⑷在步骤⑶所确定的最佳给药物质和给药剂量条件下,测定黄嘌呤在不同给药时间对秀丽隐杆线虫平均寿命的影响并结合秀丽隐杆线虫体内尿酸含量的变化,确定黄嘌呤的最佳给药时间,为18h;所述不同给药时间为0,18,24,32,48h;⑸确立秀丽隐杆线虫高尿酸模型构建方法,对由该构建方法所获得的高尿酸秀丽隐杆线虫模型进行系列实验评价,所述系列实验评价包括秀丽隐杆线虫运动能力变化评价、秀丽隐杆线虫产卵量变化评价、模型稳定性评价、别嘌呤醇药物评价、黄嘌呤氧化酶活性评价,确定高尿酸秀丽隐杆线虫模型构建方法的稳定性、可靠性以及对秀丽隐杆线虫的损伤性,确定最佳条件,即采用前体物质黄嘌呤、终浓度为0.25-0.45mg/mL、液体给药、20-25℃、18-32h,即获得低损伤性、高效、稳定、可靠的秀丽隐杆线虫高尿酸模型。7.根据权利要求5或6所述的秀丽隐杆线虫高尿酸模型的构建方法的筛选方法,其特征在于:所述步骤⑴中秀丽隐杆线虫测定前经乙腈除蛋白处理,且乙腈的加入量为:500条秀丽隐杆线虫加入乙腈5.0mL;或者,所述高效液相色谱法测定尿酸含量的条件如下:色谱柱:Intertsil ODS-SP色谱柱,5μm,4.6mm×250mm;流动相:10mmol/L的乙酸铵;检测器:紫外检测器;柱温:25℃;流速:1mL/min;进样量:30μL;标准曲线绘制:准确称取4.0mg尿酸标准品,用质量百分数为25%的氨水超声溶解定容至10mL,得到浓度为400μg/mL的尿酸标准母液,配制成浓度为0,12.5,30,60,90,120,150μg/mL的尿酸标准溶液,过膜备用;准确进样30μL,根据峰面积与标准溶液进样浓度成正比的对应关系绘制尿酸标准曲线,求得回归方程、相关系数及其线性范围;或者,所述步骤⑵中固体给药的培养具体如下:秀丽隐杆线虫所用标准培养基为NGM培养基,其配制比例及程序为3g NaCl、17g琼脂、2.5g蛋白胨、1L双蒸水,高压蒸汽灭菌后,在无菌条件下加入1mL胆固醇的浓度为5mg/mL的胆固醇无水乙醇溶液、1mL浓度为1mol/L且经高压蒸汽灭菌的MgSO4溶液、1mL浓度为1mol/L且经高压蒸汽灭菌的CaCl2溶液和25mL的1mol/L、经高压蒸汽灭菌、pH=6.0的磷酸钾缓冲液,充分混均,倒入直径为9cm的培养皿,冷却待用;其中,所述胆固醇无水乙醇溶液的制备过程为:胆固醇使用无水乙醇进行溶解且经0.45μm滤膜过滤除菌;线虫同期化,将孵化好的幼虫SM液体培养液1500-2000r/min离心2-5min收集幼虫,转到涂有大肠杆菌OP50的NGM培养基平板上,将平板置于20℃培养箱中继续培养,培养至32h后待用;不同浓度0,0.05,0.15,0.25,0.35mg/mL的药品次黄嘌...
【专利技术属性】
技术研发人员:李贞景,王昌禄,李志,熊春福,陈勉华,李风娟,武淑芬,
申请(专利权)人:天津科技大学,
类型:发明
国别省市:天津;12
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