一种新的吡喃酮类化合物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种新的吡喃酮类化合物及其制备方法和应用，所述化合物是由Streptomyces sp.1H‑GS5经培养和液体发酵，发酵液经过滤后，用甲醇提取，乙酸乙酯萃取，浓缩后硅胶柱层析、凝胶层析及C‑18柱层析所得到的化合物。本发明专利技术的新化合物具有强的人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT‑116和人肝癌细胞HepG2细胞增殖抑制活性，对我国医药的开发研究具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种吡喃酮类化合物及其制备方法和在抗肿瘤方面的应用。
技术介绍
壮观链菌素(Spectinabilin)是1976年Kakinuma等人从土壤链霉菌(Streptomyces spectabilis)中分离得到的细胞毒素，并于1994年申请了壮观链菌素的专利，保护了其制备方法及作为细胞生长抑制剂的用途(US005360918A)。其中壮观链菌素的化学结构式如下：Streptomyces sp.1H-GS5是一株从日本弓背蚁头部分离得到的产壮观链菌素的链霉菌(刘双鹤等，2015)。该菌株在燕麦琼脂培养基上形成橘红色的气生菌丝，3天后，在气生菌丝上形成直链孢子，孢子表面光滑。该菌株的16S rRNA在Genbank上的登录号为KP784764，与其相似性最高的菌株为产壮观霉素的Streptomyces spectabilis NBRC 13424，相似性为99.93％。
技术实现思路
本专利技术提供一种新的吡喃酮类化合物，其分子结构如下：本专利技术还提供了一种上述吡喃酮类化合物的制备方法，是以Streptomyces sp.1H-GS5为出发菌株，发酵、分离纯化生产上述化合物。所述制备方法，步骤如下：1)发酵培养Streptomyces sp.1H-GS5，收集发酵液；2)发酵液经100～200目筛网过滤后，滤渣用甲醇提取；3)将得到的浸提液浓缩至一定体积后用乙酸乙酯萃取，将萃取液浓缩后依次进行硅胶柱层析、凝胶层析、C-18柱层析，层析后得到该化合物。本专利技术的化合物是采用如下具体方法来制备的：1、发酵(1)发酵菌种：发酵菌种是壮观链菌素产生菌(Streptomyces sp.1H-GS5)，由东北农业大学生物化工实验室提供，保藏于“中国普通微生物菌种保藏管理中心”，保藏号为：CGMCC No.4.7313。(2)斜面培养：培养基组成按质量分数计：可溶性淀粉10％-15％，酵母抽提粉2％-3％，KNO3 1％-2％，琼脂粉20％-25％，pH 7.0-7.2，用去离子水配制，于121℃下灭菌20-25min。接菌后置于28℃培养箱中，培养4-5d。(3)种子培养：种子培养基组成按质量分数计：葡萄糖20％-25％，黄豆饼粉15％-20％，酵母水解物5％-10％，pH 7.0-7.2，用蒸馏水配制，于121℃下灭菌20min。向菌种斜面上加入10ml无菌水，用已灭菌的接种环刮下孢子制成孢子悬液，使其浓度为107-108c.f.u.ml-1。然后取2ml孢子悬液接种于种子培养摇瓶中，种子摇瓶装液量为25ml/250ml，置于250rpm旋转式摇床，28℃培养46-52h。(4)发酵：发酵培养基组成按质量分数计：玉米淀粉10％-15％，黄豆饼粉1％-2％，棉籽饼粉1％-2％，α-淀粉酶0.02％-0.03％，NaCl 0.1％-0.2％，K2HPO4 0.2％-0.3％，MgSO4·7H2O 0.1％-0.15％，CaCO3 0.7％-1.0％，环己烷羧酸0.1％-0.15％，pH 7.0-7.2，用蒸馏水配制，于121℃下灭菌20min。按8％(V/V)接种量，将种子液接入到1L发酵摇瓶中，发酵摇瓶的装液量为100ml/1L。置于250rpm旋转式摇床，28℃发酵培养6-7d。2、发酵液处理(1)发酵液经100～200目筛网过滤后，滤渣用3-4倍体积甲醇提取。(2)将得到的浸提液浓缩至一定体积后用等体积乙酸乙酯萃取3-4次，将萃取液浓缩后依次进行硅胶柱层析、凝胶层析、C-18柱层析，层析后得到该化合物。所述硅胶柱层析用到的填料是100～200目的硅胶，流动相为体积比石油醚：丙酮＝100:0-50:50进行梯度洗脱(流速为50-100ml/min，每个梯度持续30-40min，每个梯度收集3-4L)，收集洗脱液，薄层层析(TLC)检测合并相同组分。所述凝胶层析用LH-20凝胶，MeOH：CHCl3＝1：1等度洗脱，流速为10-20ml/min，收集洗脱液，薄层层析(TLC)检测合并相同组分。所述C-18柱层析，其中使用充满了C-18反相填料，并且使用的混合溶剂为乙腈70％-90％(V/V)的水溶液，甲醇的水溶液70％-90％(V/V)或者甲醇40％-45％(V/V)、乙腈40％-45％(V/V)混合有机溶剂的水溶液等度洗脱，流速为1.0-2.0mL/min。，收集保留时间为42.7min的峰得到新化合物。本专利技术提供的化合物具有抑制肿瘤的活性，可以用作细胞抑制剂。有益效果：采用本专利技术的方法得到的化合物具有很强的抑制肝癌、肺癌以及结肠癌的细胞活性，具有广泛的应用价值，对我国医药的开发研究具有重要意义。本专利技术所涉及的新吡喃酮类化合物为壮观链菌素衍生物，其抗肿瘤活性显著高于壮观链菌素。具体实施方式实施实例11、化合物制备：发酵(1)斜面培养：培养基组成：可溶性淀粉10％，酵母抽提粉2％，KNO3 1％，琼脂粉20％，pH 7.0-7.2，用去离子水配制，于121℃下灭菌20min。接菌后置于28℃培养箱中，培养4-5d。(2)种子培养：种子培养基组成：葡萄糖20％，黄豆饼粉15％，酵母水解物5％，pH 7.0-7.2，用蒸馏水配制，于121℃下灭菌20min。向菌种斜面上加入10ml无菌水，用已灭菌的接种环刮下孢子制成孢子悬液，使其浓度为107c.f.u.ml-1。然后取2ml孢子悬液接种于种子培养摇瓶中，种子摇瓶装液量为25ml/250ml，置于250rpm旋转式摇床，28℃培养46h。(3)发酵：发酵培养基组成：玉米淀粉10％，黄豆饼粉1％，棉籽饼粉1％，α-淀粉酶0.02，NaCl 0.1％，K2HPO4 0.2％，MgSO4·7H2O 0.1％，CaCO3 0.7％，环己烷羧酸0.1％，pH 7.0-7.2，用蒸馏水配制，于121℃下灭菌20min。按8％(V/V)接种量，将种子液接入到1L发酵摇瓶中，发酵摇瓶的装液量为100ml/1L。置于250rpm旋转式摇床，28℃发酵培养6d。2、化合物分离30L发酵液经200目筛网过滤得到菌丝体滤饼3L。滤饼用去离子水洗后再用10L工业甲醇浸泡过夜，过滤得甲醇提取液。所得提取液在50℃减压浓缩去除甲醇相直至剩余约2L，然后用等体积乙酸乙酯分别萃取三次得乙酸乙酯萃取液，萃取液在减压条件下浓缩至干，得到25g油状物质。将所得的油状物质上硅胶柱(粒径100～200目)进行层析，用石油醚：丙酮＝100:0-50:50(V/V)进行梯度洗脱，50ml/min，收集洗脱液，薄层层析(TLC)检测合并相同组分，得到4个组分(1-4)。将组分1经凝胶LH-20柱层析,MeOH：CHCl3＝1：1等度洗脱，流速为20ml/min，收集洗脱液，薄层层析(TLC)检测合并相同组分，得到组分1-1，组分1-1经HPLC进一步分离纯化，得到目的产物(15.6mg)。HPLC条件如下：液相系统：Agilent 1100半制备高压液相色谱仪色谱柱:ZORBAX SB-C18(250mm*9.4mm)洗脱剂：甲醇/乙腈/水＝4:4:2(V/V/V)流速：1.5mL/min检测波长：λ＝254nm收集保留时间为42.7min的峰得到新化合物通过1D和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新的吡喃酮类化合物，其特征在于：结构式如下：

【技术特征摘要】
1.一种新的吡喃酮类化合物，其特征在于：结构式如下：2.一种权利要求1所述的新的吡喃酮类化合物的制备方法，其特征在于：以壮观链菌素产生菌Streptomyces sp.1H-GS5为出发菌株，经发酵及分离纯化得到产物。3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：发酵前需对菌株进行斜面培养、种子培养。4.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于：所述发酵，培养基组成按质量分数计：玉米淀粉10％-15％，黄豆饼粉1％-2％，棉籽饼粉1％-2％，α-淀粉酶0.02％-0.03％，NaCl 0.1％-0.2％，K2HPO4 0.2％-0.3％，MgSO4·7H2O 0.1％-0.15％，CaCO3 0.7％-1.0％，环己烷羧酸0.1％-0.15％，pH 7.2-7.4，用蒸馏水配制，灭菌；将种子培养所得的种子液接入到发酵培养基中，置于旋转式摇床，28℃发酵培养6-7d。5.根据权利要求3所述方法，其特征在于：所述斜面培养，培养基组成按质量分数计：可溶性淀粉10％-15％，酵母抽提粉2％-3％，KNO3 1％-2％，琼脂粉20％-25％，pH 7.0-7.2，用去离子水配制，灭菌；接菌后置于28℃培养4-5d，将培养得到的孢子用无菌水配置成107-108c.f.u.ml-1的孢子悬液备用。6.根据权利要求3所述方法，其特征在于：所述种子培养，种子培养基组成按质量分数计：葡萄糖20％-...

【专利技术属性】
技术研发人员：向文胜，刘重喜，王继栋，刘双鹤，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23