一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸制造技术

本实用新型专利技术涉及免疫层析检测技术领域，具体涉及一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线a、检测线b、质控线和PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸水纸依次搭接在所述PVC底板上，所述检测线a、检测线b、所述质控线依次包被于硝酸纤维素膜，所述结合垫包被有NGAL、HbA1c单克隆抗体—胶体金标记物层；所述检测线a包被有NGAL单抗，所述检测线b包被有HbA1c单抗，所述质控线包被有羊抗鼠IgG；采用本方案的一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸具有灵敏度高、特异性强、操作简便、批间差异小、检测快速、准确的优点。

【技术实现步骤摘要】

本技术涉及免疫层析检测
，具体涉及一种采用胶体金免疫层析法测定人血液中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和糖化血红蛋白含量的一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸。
技术介绍
NGAL分子量为25kD，是脂质运载蛋白lipocalin超家族的2号成员，Kjeldsen在1993年在人中性粒细胞中发现。NGAL与明胶酶B，即基质金属蛋白酶9(MMP-9)共价结合，形成1351kD的异二聚体蛋白，由人类中性粒细胞分泌。研究表明，机体暴露在外界有害理化及生物因素下，全血NGAL浓度明显高于正常水平。现代研究显示，生理状态下，NGAL不仅在中性粒细胞表达，还在其他一些组织如胃壁细胞、肝胆管细胞、小肠潘氏细胞和肾近曲小管细胞等均有表达。NGAL参与不同的生理及病理过程，涉及炎症免疫应答、肿瘤的发生发展的各阶段，并且与肾损伤的发生发展密不可分。在缺血、中毒等损伤因素造成肾小管上皮细胞NGAL高表达，使其在血液和尿液中能够被检出，而且升高早于血肌酐升高。NGAL作为新型AKI早期诊断标志物，在缺血性、脓毒性、肾移植以及早期糖尿病等的情况下均能在尿液和血液中检测到，并且灵敏度高，能作为更早的诊断指标。糖化血红蛋白(HbA1c)是人体血液中红细胞内的血红蛋白与血糖结合的产物。血糖和血红蛋白的结合生成糖化血红蛋白是不可逆反 应，并与血糖浓度成正比，且保持120天左右，所以可以观测到120天前。糖化血红蛋白的含量变化可以作为糖尿病监测和诊断的指标。我国肾病患者已达1.5亿人，其中糖尿病患者已高达9800万人，其他检测方法由于时间长、费用高。为我国糖尿病和肾病监控和诊断带来了巨大的困难。鉴于此，本技术研究和设计了一种检测人血液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和糖化血红蛋白的一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸。
技术实现思路
本技术的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便、批间差异小、检测快速、准确并适合床旁检测人血液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白含量和糖化血红蛋白(HbA1c)的一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，以便对急性肾损伤、糖尿病的早期诊断和治疗监控。为实现上述目的，本技术提供一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线a、检测线b、质控线和PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸水纸依次搭接在所述PVC底板上，所述检测线a、检测线b、所述质控线依次包被于硝酸纤维素膜，所述结合垫包被有NGAL、HbA1c单克隆抗体—胶体金标记物层；所述检测线a包被有NGAL单抗，所述检测线b包被有HbA1c单抗，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。本技术一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的制备方法，包括以下步骤：步骤一、胶体金的制备：取1个500mL圆底烧瓶，加入100mL去离子水，圆底烧瓶上端接一回流冷凝管，于恒温磁力搅拌器上使用温度档350℃对其进行加热，转速420r/min，加热至第5min，加入125μL 1％氯金酸。继续加热5min至沸腾状态后，沸腾的标准是水温为100℃，向圆底烧瓶中快速加入250μL 10％柠檬酸三钠溶液，圆底烧瓶中溶液由紫变红后继续加热反应10min，直至溶液透亮后，停止加热，继续以420r/min搅拌5min，冷却至室温，4℃密封保存，即制得胶体金。步骤二、金标抗体的制备：取1mL胶体金于1.5mL离心管中，调节pH至8.5。向离心管中加入10μg/mL的NGAL单克隆抗体、8ug/mL的HbA1c单克隆抗体，混匀后静置10min，向离心管中加入100μL 10％BSA溶液，混匀后静置5min，制得金标抗体，即NGAL、HbA1c抗体—胶体金标记物。将制得的金标抗体溶液于4℃13500r/min离心10min，去除上清液，将沉淀用金标稀释溶液稀释至原体积3/2，于4℃保存备用。步骤三、NGAL单克隆抗体、HbA1c单克隆抗体、羊抗鼠IgG包被：取稀释至0.5mg/mL NGAL单克隆抗体、0.5mg/mL HbA1c单克隆抗体和1.0mg/mL羊抗鼠IgG，采用dispent划膜仪分别包被至硝酸纤维素膜的检测线a、检测线b和质控线位置。其中0.5mg/mL NGAL单克隆抗体中含0.3％甲醇，0.5mg/mLHbA1c单克隆抗体中含 2.5％蔗糖，检测线a距质控线距离为14mm，检测线b距质控线距离为8mm，划膜浓度均为1μL/cm，平台移动速度为40mm/s。步骤四、试纸条的组装：(1)将硝酸纤维素膜，即NC膜，和吸水纸分别粘贴于PVC底板上，吸水纸压住NC膜上方2mm；(2)将粘贴好NC膜和吸水纸的PVC底板在切条机上切割成4mm宽的试纸(3)将样品垫和结合垫切成4mm宽的条，同时将结合垫浸泡于金标抗体溶液中，并放置于37摄氏度恒温恒湿干燥箱中烘干，制得金标垫；(4)烘干后的金标垫按长度1cm进行裁剪。将金垫粘贴于PVC底板上，压住NC膜下方2mm，同时用样品垫压住金标垫下方2mm。与现有技术相比，本技术具有下列优点：1、本技术的检测人血液中中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白和糖化血红蛋白一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，具有特异性强、灵敏度高、检测时间短、批间差异小、结果稳定可靠等优点2、本技术的检测试纸条检测时间短，出报告时间快。3、本技术的检测试纸条操作简便，不需要专业人员操作。4、本技术对胶体金的制备实现程序化操作，大大降低了批间差异。 5、本技术的抗体标记时间短，比传统时间缩短了30min以上。6、本技术的样品垫和金垫具有优异的释放能力和吸水能力，有着更高准确度。7、本技术中抗体在NC膜上包被方式可以提高免疫层析试纸条的稳定性和亲水性。8、本技术采用氯化钠破坏法确定最终抗体标记浓度，提高试纸条灵敏度的同时降低抗体用量，节约了成本。附图说明图1为本技术一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的结构示意图：图2为本技术一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸检测模式图；图3为制备本技术一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的NGAL的线性范围相关性；图4为制备本技术一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的HbA1c的线性范围相关性。其中，1为样品垫，2为结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为吸水纸，5为检测线a，6为检测线b，7为质控线，8为PVC底板，9为加样孔，T为层析方向。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本技术作进一步详细的说明：如图1、2所示本技术揭示了一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，包括样品垫1、结合垫2、硝酸纤维素膜3、吸水纸4、检测线a 5、检测线b 6质控线7和PVC底板8。所述样品垫1、所 述结合垫2、所述硝酸纤维素膜3及所述吸水纸4依次粘接在所述PVC底板8上；所述结合垫2包被有NGAL、HbA1c克隆抗体—胶体金标记物；所述检测线a 5上包被有中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白单克隆抗体，所述检测线b 6上包被有糖化血红蛋白单克隆抗体，所述质控线7上包被有羊抗鼠IgG。一种制备一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸的制备方法，包括以下步本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，其特征在于：包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线a、检测线b、质控线和PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸水纸依次搭接在所述PVC底板上，所述检测线a、检测线b、所述质控线依次包被于硝酸纤维素膜，所述结合垫包被有NGAL、HbA1c单克隆抗体—胶体金标记物层；所述检测线a包被有NGAL单抗，所述检测线b包被有HbA1c单抗，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。

【技术特征摘要】
1.一种检测NGAL和糖化血红蛋白的检测试纸，其特征在于：包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线a、检测线b、质控线和PVC底板，所述样品垫、所述结合垫、所述硝酸纤维素膜及所述吸水纸依次搭接在所述PVC底板上...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷均平，田奇，曾繁兵，
申请(专利权)人：深圳市博卡生物技术有限公司，
类型：新型
国别省市：广东;44