本发明专利技术公开了一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法及试剂盒；包括在检测反应杯内表面包被MPO单抗或多抗；将时间分辨荧光微球与MPO单抗或多抗共价键交联制备得到荧光标记抗体；将待测MPO样品加入包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗体，25℃～40℃温育；清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，在340～380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号；将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测MPO样品的MPO浓度。本发明专利技术可以在较短的检测时间内完成检测，缩短了检测时间，并有效的提高了检测灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及MPO检测
，具体涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法及试剂盒。
技术介绍
心血管疾病是危害人类健康及生命的严重疾病，已成为21世纪人类健康的头号杀手。2009年8月拜耳医药在欧洲心脏病学会年会上报道指出2005年全球约有1750万人死于心血管疾病，预计2015年这一数字将攀升到2000万人，大约有一半病例发生在亚太地区。生活条件的改善和生活方式的转变，使中国人发生心血管疾病的风险迅速赶超美国等发达国家。我国1990年城市居民心血管疾病死亡率为92/10万人，2000年为106/10万人，平均每年死亡增长率为1.3％。2008年死亡率已达到121/10万人，相比2000年时，平均死亡增长率为1.4％，其中急性心肌梗塞的死亡率占到其中的三分之一，说明心肌梗塞死亡率仍呈不断增长趋势。随着中国人口老龄化趋势，按平均死亡增长率为1.5％计算，到2015年，血管疾病死亡率将达到141/10万人，急性心肌梗塞的死亡率将达到47/10万人。中国卫生部2008年公布的急性心肌梗塞的死亡率为39.72/10万人，每年急性心肌梗塞的发病人数超过500万人，至少有超过200万的人群去医院就医进行心肌梗塞疾病的相关检测，这并不包含每年因胸痛怀疑为心肌梗塞的病人人数，实际医院每年检测人数已达千万人次。心肌梗塞的典型临床症状是胸痛，心律失常，心力衰竭等。但实际临床上胸痛的症状表现复杂多样，危险性差异也较大，还有心梗病人无典型症状。医学上将急性心肌梗死发病后6小时以内作为抢救的“黄金时间”，超过这个时间段，治疗效果就会大打折扣，甚至产生严重后果危及生命。中华医学检验分会2006年制定的“冠状动脉疾病和心力衰竭时心脏标志物临床检测应用建议”指出，适用于临床的心脏标记物应具有较好的诊断、危险分层和预后估计的价值，分析检测方法应特异、灵敏、快速，而且心脏标志物的检测周转时间＜60min。髓过氧化物酶(MPO)与冠状动脉疾病密切相关。冠心病是心血管系统中最常见的疾病，而动脉粥样硬化(AS)又是形成冠心病的重要病理基础。AS发病过程中通常出现氧化低密度脂蛋白，进而巨噬细胞吞噬脂质变成泡沫细胞，泡沫细胞的形成在AS的发生机制中起关键作用。协和洛克研究发现MPO有促进AS病变形成的作用，MPO通过产生自由基和多种反应性物质，促进斑块形成和不稳定性增加，加速AS进展，进而引起多种并发症如急性冠脉综合征(ACS)。研究发现，MPO缺陷的个体罹患心血管疾病的危险性明显下降。MPO水平的升高不仅与患冠状动脉疾病易感性相关，还可以预测早期患心肌梗死的危险性。MPO促进ACS病变形成，并影响粥样斑块的稳定性，通过增大氧化应激而引起ACS。研究表明，MPO是预测ACS患者发生不良心血管事件的一个新的预测因子，特别是在肌钙蛋白T(TnT)水平较低的患者，MPO能够识别那些将来发生心血管事件危险性较高的患者。传统上MPO多用化学发光法及胶体金免疫层析法或者荧光免疫层析法等方法测定。化学发光法对技术要求高，操作步骤相对比较繁琐，需要多步试剂添加过程。胶体金免疫层析法虽然具有标本用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到某些样品中抗原或抗体含量极低时，胶体金的颜色将很浅甚至无显色，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度较低。荧光免疫层析法虽然灵敏度比胶体金免疫层析法要高，但是其检测精密度并不理想，灵敏度与大型化学发光或者电化学发光仪器仍有差距。时间分辨荧光(Time-resolved Fluorescence，TRF)是一种非同位素荧光标记物，与普通荧光相比，具有stock位移大，荧光寿命长等特点，可以有效的避免样品中的本底荧光，以及激发光等杂散光的影响，因此相比普通荧光具有更高的灵敏度和抗干扰能力。目前市面上采用时间分辨荧光检测的试剂均采用解离增强镧系元素荧光免疫分析(DELFIA)，它采用具有双功能基团结构的螯合物，使其一段与铕(Eu)连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应后形成免疫复合物，由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，需要加入一种解离增强剂，使得铕离子从复合物上解离下来，并与增强剂中的另一种螯合剂形成胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有荧光免疫层析法测定MPO检测精密度不理想以及时间分辨荧光检测法需要解离增强过程，检测步骤繁杂、时间长、精度差等不足，提供一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法及试剂盒。该方法基于时间分辨荧光微球可高灵敏度定量检测MPO。本专利技术的目的是通过以下技术方案来实现的：第一方面，本专利技术涉及一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，所述方法包括如下步骤：S1、在检测反应杯内表面包被针对MPO特定抗原识别位点的一个或多个抗体(所述抗体为单克隆抗体或者多克隆抗体，或者多个抗体的组合形式；即，包被MPO单抗或者多抗)；S2、将时间分辨荧光微球与MPO单抗或者多抗通过共价键交联制备得到荧光标记抗体；S3、将待测MPO样品加入步骤S1包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗体，25℃～40℃温育；S4、清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，在340～380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号；S5、将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测MPO样品的MPO浓度。优选的，所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物。优选的，所述镧系元素螯合物为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen(其中TTA为噻吩甲酰三氟丙酮(Thenoyltrifluoroacetone)，TOPO为三辛基氧化膦，Phen为邻菲咯啉)。优选的，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为100～1000nm。优选的，所述时间分辨荧光微球为前处理后的羧基时间分辨荧光微球；所述前处理包括：加入MES、EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混匀15～60min，加入MES、NHS和EDC进行再次活化处理；每1mg羧基时间分辨荧光微球对应10～100ul 50mM氨基己酸。更优选的，所述初次活化处理包括：每1mg羧基时间分辨荧光微球，加60ul500mM MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液pH5.0～7.0，加0.02～0.2mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，加纯化水至终体积400μL，室温混匀15～30min；所述再次活化处理包括：加入所述氨基己酸室温混匀后，加1mL
100mM MES pH6.0，15000rpm离心清洗10～25min，弃去上清；加400ul 100mM MESpH5.0～7.0，超声分离，加0.02～0.2mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，加0.01～0.1mgEDC，室温混匀10～20min；加1mL 100mM MES pH5.0～7.0缓冲液，15000rpm离心清洗10～25min，弃去上清；100mM MES pH5.0～7.0缓冲液恢复到1ml。优选的，步骤S2中，还包括将共价键交联制备得到的荧光标记抗体进行封闭、清洗后用反应缓冲液稀释到终浓度到50μg/ml，作为检测用荧光标记抗体的步骤；所述每1L反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、在检测反应杯内表面包被MPO单抗或者多抗；S2、将时间分辨荧光微球与MPO单抗或者多抗通过共价键交联制备得到荧光标记抗体；S3、将待测MPO样品加入步骤S1包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗体，25℃～40℃温育；S4、清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，在340～380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号,检测波长为600～630nm；S5、将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测MPO样品的MPO浓度。
【技术特征摘要】
1.一种基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、在检测反应杯内表面包被MPO单抗或者多抗；S2、将时间分辨荧光微球与MPO单抗或者多抗通过共价键交联制备得到荧光标记抗体；S3、将待测MPO样品加入步骤S1包被后的检测反应杯内，再加入所述荧光标记抗体，25℃～40℃温育；S4、清洗去除未结合的抗原及荧光标记抗体，在340～380nm激发光激发下，测试检测反应杯中荧光信号,检测波长为600～630nm；S5、将所述荧光信号与标准曲线比对，获得所述待测MPO样品的MPO浓度。2.根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球中填充了镧系元素螯合物。3.根据权利要求2所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述镧系元素螯合物为Eu(TTA)3/TOPO或Eu(TTA)3/Phen。4.根据权利要求1所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球的粒径范围为100～1000nm。5.根据权利要求1～4中任一项所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述时间分辨荧光微球为前处理后的羧基时间分辨荧光微球；所述前处理包括：加入MES、EDC进行初次活化处理，加入氨基己酸室温混匀15～60min，加入MES、NHS和EDC进行再次活化处理；每1mg羧基时间分辨荧光微球对应10～100ul 50mM氨基己酸。6.根据权利要求5所述的基于微球的杯式时间分辨荧光MPO分析方法，其特征在于，所述初次活化处理包括：每1mg羧基时间分辨荧光微球，加60ul 500mMMES缓冲液pH5.0～7.0，加0.02～0.2mgEDC，加纯化水至终...
【专利技术属性】
技术研发人员：石晓强，徐建新，李福刚，周奕璇，杨晶，
申请(专利权)人：上海奥普生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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