本发明专利技术公开了一种猪嵴病毒的可视化逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括RT‑LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪嵴病毒RNA模板；所述的RT‑LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB，其应用包括使用该试剂盒检测猪嵴病毒病变组织和带毒粪便。特异性检测和敏感性检测证实，本发明专利技术提供的逆转录环介导等温扩增试剂盒可实时监测反应并且定量检测出猪嵴病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪嵴病毒带来便利。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种猪嵴病毒的可视化逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用，该试剂盒包括RT?LAMP引物、2×反应缓冲液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪嵴病毒RNA模板；所述的RT?LAMP引物包括外引物F3与B3、内引物FIP与BIP和环引物LF与LB，其应用包括使用该试剂盒检测猪嵴病毒病变组织和带毒粪便。特异性检测和敏感性检测证实，本专利技术提供的逆转录环介导等温扩增试剂盒可实时监测反应并且定量检测出猪嵴病毒的拷贝数，快速准确的获得检测结果，为简便、快速和可靠的检测猪嵴病毒带来便利。【专利说明】 一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩増试剂盒及其应用
本专利技术涉及微生物检测
，具体说是涉及一种快速、可视化并且可实时定 量检测猪嵴病毒的逆转录环介导等温扩增试剂盒及其应用。
技术介绍
猪崎病毒(Kobuvirus，Kobu)为单股正链RNA病毒，属于微RNA病毒科崎病毒属，病 毒颗粒直径约30nm，呈20面体对称，无嚢膜。1998年在日本爱知(Aichi)县肠胃炎病人粪便 标本中发现一种新型RNA病毒，根据发现地点命名为爱知病毒(Aichi virus)，1997年通过 基因分析，证实爱知病毒是一种新型的微RNA病毒。因病毒粒子电镜下崎岖不平呈嵴状，命 名为嵴病毒。目前，嵴病毒已经在牛、猪和绵羊3种动物和人体内被发现，另外在蝙蝠体内也 检测出类似嵴病毒的病毒。嵴病毒已经被证实与人的腹泻疾病相关，并且在不同人群中广 泛流行。自2008年匈牙利Pankovic博士在利用RT-PCR方法检测10日龄仔猪腹泻样品中否存 在诺瓦克病毒(Norovirus)感染时，扩增出猪嵴病毒，此后，猪嵴病毒在匈牙利、中国、泰国、 日本和韩国等国家相继被报道。有资料表明，2010~2011年，我国不同省份猪嵴病毒阳性率 高达82.9%，表明我国猪群中存在嵴病毒感染，并且感染率较高，可能与猪腹泻疾病的诱发 有关。 对猪嵴病毒的快速准确诊断，可以进一步研究猪嵴病毒是否猪群肠道疾病的继发 或诱导因素，及之与人类腹泻疾病之间的相关性。目前实验室诊断PKV的方法主要为普通 RT-PCR和实时荧光定量PCR，虽然PCR方法较准确，但需要昂贵的仪器设备，成本较高，在结 果判定上需要进行琼脂糖凝胶电泳，容易造成实验室污染导致出现假阳性结果，用时也较 长，不适合基层和现场检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了解决基层检测猪嵴病毒困难、耗时长和仪器昂贵等问题，提供一 种为基层简便、快捷准确地检测猪嵴病毒的试剂盒，为实现本专利技术目的所使用的技术方案 为:一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括RT-LAMP引物、2 X反应缓冲 液、EM、荧光目视检测试剂、超纯水和猪嵴病毒RNA模板;所述的RT-LAMP引物包括外引物F3 (SEQ ID N0:1)与B3(SEQ ID N0:2)、内引物FIP(SEQ ID N0:3)与BIP(SEQ ID N0:4)和环引 物LF(SEQ ID N0:5)与LB(SEQ ID N0:6); 其中： 所述的2X 反应缓冲液是 1^丨8-11(^、1((^、]\%5〇4、（順4)23〇4、1￥661120、86七31116和(1犯138。 以上所述的猪嵴病毒RNA模板是使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取的猪嵴 病毒的RNA。 以上所述的荧光目视检测试剂采用钙黄绿素荧光试剂，荧光试剂在反应前加入。 以上所述的2X 反应缓冲液包括1>18-?^35-5〇111]\1、1((^15-35111]\1、]\^5〇4 15-20mM、（NH4)2S〇4 15-25mM、Tween20 0.4-0.8 %、Betaine 1.5-3.0M 和dNTPs 2.5-4mM，其配 制方法在pH为8.7条件下，将上述溶剂混合均匀获得。 -种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒的应用，用于兽医临床上检测疑似猪 嵴病毒病变组织、猪粪便排泄物或培养物中是否含有猪嵴病毒，具体检测步骤包括： (1) RT-LAMP引物的设计与合成 (2) 猪嵴病毒RNA模板的提取 (3 ) RT-LAMP反应体系建立 (4)RT-LAMP检测方法。 以上所述的RT-LAMP反应体系建立以25yL计， 2 X反应缓冲液 12.5yL EM lyL FIP 40 pmol BIP 40 pmol LF 20 pmol LB 20 pmol F3 5 pmol B3 5 pmol 猪嵴病毒RNA 5yL 超纯水 补足25uL。 以上所述的RT-LAMP检测方法是采用特异性检测、敏感性检测和荧光可视化检测 的方法。 以上所述的RT-LAMP检测方法采用Loopamp LA-320C实时浊度仪进行密闭全程监 控，反应温度为63°C、反应在20-30分钟间出现扩增。本专利技术的实质性特点和进步是： 1)特异性强 本专利技术的RT-LAMP检测试剂盒特异性检测的阴性对照病毒和水对照均无阳性结果出 来，与PCR检测结果一致。且操作简便、快速获得检测结果、无需昂贵复杂的仪器。 2)灵敏度高 普通PCR检测方法的灵敏度为9.38X 1(T8 ng/yL，而使用本专利技术的RT-LAMP检测方法，检 测限约为9 ? 38 X 10-9 ng/yL，是普通PCR的10倍。 3)迅速获得结果 普通的RT-PCR整个过程在24小时左右才能得出结果，目前多数建立的RT-LAMP反应方 法在反应结束后，须采用琼脂糖凝胶电泳紫外线分析显像来判定结果，从病毒基因组RNA提 取到获取试验结果，需要4-5小时左右。本专利技术提供的RT-LAMP检测方法反应在23分钟左右 出现扩增，60分钟内即可完成扩增，且结果判读方式简便，在可见光下将阳、阴性管进行比 较，通过肉眼可明显看到阳性反应呈明显浑浊，阴性反应管透明；短暂离心后，阳性反应管 底部有明显的白色焦磷酸镁沉淀物，而阴性反应管底部无沉淀物;或加入荧光染料，阳性反 应管在紫外光下呈绿色，用肉眼便可观察实验结果。不需要再进行琼脂糖凝胶电泳紫外线 分析显像来判定结果，从基因组RNA提取到获得最终结果可在2-3小时内完成。 4)不造成污染 目前RT-LAMP方法用于直接观察的荧光染料为反应后加入，而本专利技术的荧光染料是在 反应前加入的钙黄绿素商用染料(非syber-green)，检测过程不需要开盖。此外，本专利技术的 RT-LAMP检测方法在结果判定上，直接通过浊度仪检测反应管的浊度值来判定结果，可不进 行荧光染料法检测结果或者进行琼脂糖凝胶电泳检测结果，不需要开盖，能有效避免污染。 5)可实时定量 本专利技术利用Tubidimeter real-time LA-320池度仪来实时分析RT-LAMP反应的结果， 不同的标准样品的浓度对应的浊度值的时间绘制成的标准曲线，代入标准曲线方程，即可 求出各时间的猪嵴病毒拷贝数，达到定量检测产物的目的。【附图说明】 图1是本专利技术的RT-LAMP方法特异性检测结果，其中1:猪嵴病毒;2:猪蓝耳病病毒； 3:猪圆环病毒2型;4:猪瘟病毒;5:猪轮状病毒;6:流行性腹泻病毒;7:传染性胃肠炎病毒； 8:猪伪狂犬病毒;9:空白对照（水）。猪嵴病毒反应管出现池度的上升曲线，7株对照病毒反 应管和水对照反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种猪嵴病毒逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，包括RT‑LAMP引物，其引物包括外引物F3（SEQ ID NO：1）与B3（SEQ ID NO：2）、内引物FIP（SEQ ID NO：3）与BIP（SEQ ID NO：4）和环引物LF（SEQ ID NO：5）与LB（SEQ ID NO：6）； 引物的序列分别为：F3 ACATCGCGATCTCCGTCGB3 CTGCTGGATCATCCGTGATGFIP CGCAGGTAAACAGGAGGGCC GCTACCACCCCTATCCCACBIP ACCTCCCCGGTGTTGTGGAA GTGCACCACAGAGACCCTLF AGAGAGAGTGGAAATAAGATGTCCALB AACCTACAGCTTATGGTTACAAAGC。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张宁，卢冰霞，刘磊，何颖，秦毅斌，郭旋，蓝常力，赵武，李斌，段群棚，周英宁，梁家幸，杨思仪，蒋冬福，苏乾莲，
申请(专利权)人：广西农垦永新畜牧集团金光有限公司，广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
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