本文公开了脂质体和/或纳米脂质体包封的HSP90a、HPf多肽(115个氨基酸)及新的多肽HPfΔC1(101个氨基酸)和HPfΔC2(87个氨基酸)，以及生产/制备和使用所述组合物的方法。提供了包含HSP90a、HPf‑多肽、HPfΔC1或HPfΔC2多肽的嵌合的融合蛋白。提供了能够表达所述嵌合的融合蛋白的转化的细胞系和表达载体。描述了使用表达载体和转化的细胞系制备大量重组HSP90a、HPf多肽、HPfΔC1或HPfΔC2多肽的方法。提供了局部递送及其他递送形式的制剂，以及使用所述制剂的方法，包括改善皮肤状况(特应性皮炎、皱纹、皮肤弹性、暗斑(色素沉着过度)、全面皮肤护理、皮肤老化)的治疗性和化妆性应用的方法。本文公开了促进伤口愈合的脂质体制剂及其使用方法，以及抑制皮下脂肪细胞分化和降低皮下脂肪形成的方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】专利技术背景相关申请的交叉引用该国际申请是2014年8月9日于韩国受理局递交的。本PCT申请要求享有2013年8月9日递交的韩国专利申请10-2013-0094930的优先权。
本专利技术涉及适用于局部施用的组合物，所述组合物包含具有药理活性的多肽，所述多肽被包封于脂质体和/或纳米脂质体内。本专利技术还涉及制备脂质体和/或纳米脂质体制剂的方法。本专利技术还涉及改善和/或治疗皮肤状况、促进伤口愈合以及抑制皮下脂肪形成的方法。相关技术热休克蛋白90a(下文简称HSP90a)是由两个含有磷酸基团的单体组成的二聚体，其分子量为90KD。在某些条件下，例如在水溶液中时，这两个单体倾向于变得容易寡聚化。已知大多数热休克蛋白在细胞内发挥功能。其他报道表明一些热休克蛋白在细胞外发挥作用，显示了替代性生理作用。有人提出了HSP90a在免疫调节中的作用10,12。然而，尚未对HSP90a进行系统性研究，其也没有被描述为具有任何影响皮肤状况的活性，如特应性皮炎或皮肤老化，或影响皮下脂肪形成或积聚。HSP90a片段相对大的尺寸排除了将该分子用于局部制剂中，因为其无法渗透皮肤的真皮层6。特应性皮炎(AD)是由角质层缺陷引起的慢性皮肤病症，其通常被认为是特发性的9。它影响到成人及儿童。已知在流行病学上其与遗传4或环境原因7以及免疫学因素9有关。至今没有已知的AD治愈疗法，尽管治疗可减低皮炎斑的严重性和频率。治疗特应性皮炎的常用组合物包括具有抗组胺、类固醇或免疫抑制特性的基于小分子的化合物。或者，可尝试系统性免疫抑制剂，如环孢霉素、甲氨蝶呤、干扰素γ-lb、霉酚酸酯和硫唑嘌呤4。然而由于这些基于小分子的化合物伴随有严重的副作用，如长期施用后免疫功能退化，人们亟需治疗这些和其他病况的克服这些障碍的新材料。不同于基于小分子的药物，使用多肽作为活性成分治疗皮肤病症和/或制备皮肤化妆品具有明显的优势。例如，多肽与免疫系统和细胞相互作用通常更具相容性，且通常通过前生理学方式在体内分解，因此，尤其是在长期使用期间，相比含有小分子(化学品)的制剂，多肽产生更少的副作用。而且，当涉及用于药妆制剂中时，包含小分子的化妆品通常仅产生短期的化妆效果，而包含多肽的药妆制剂已经记载其提供更长期的全面皮肤状况改善，甚至皮肤护理3。然而，很多潜在的有用多肽的总体尺寸和庞大体积阻碍了这些成分渗透到皮肤组织中。传统上，由于皮肤的角蛋白屏障6，具有500道尔顿或更高的分子量的大分子被认为太大而不能透过皮肤的表皮。即使当与化学渗透促进剂一起使用时，分子量大于2000道尔顿的大分子被认为用于局部使用实际上是难以置信的，因为它们无法渗透过皮肤的表皮。因此，被开发为药用/化妆用成分的肽已被局限于具有很小尺寸的那些肽，如尺寸小于10个氨基酸(大概约1100道尔顿分子量)，以便优化所述活性成分至皮肤真皮的递送。因此，尺寸为10个氨基酸或更大的很多潜在的有用多肽没有被应用于局部制剂中。需要将活性成分如多肽递送至皮肤的真皮层，以便通过功能性药用/化妆用制剂来提供最具药学意义的结果。已报道了基于脂质体递送人生长激素(hGH)，其分子量22,124道尔顿(191个氨基酸大小)1-3。然而，与有效地局部递送其他药理学上不同的肽/蛋白如热休克蛋白Hsp90a有关的挑战依然存在。115个氨基酸的热休克蛋白片段(称为HPf)，由跨越天然内源性HSP序列的连接子和中间结构域的氨基酸序列编码(图1)。已报道了该片段改善了由糖尿病溃疡引起的皮肤坏死8。然而，递送产品的改善缺乏促进这些和相关多肽的充分利用和配制。皮下脂肪是分布最广泛的皮下组织层，其主要由脂肪细胞组成。身体不同区域的脂肪细胞数目各不相同，其大小也根据身体的营养状态而不同(SubcutaneousTissue.MedicalSubjectHeadings(MeSH).NLMRetrieved5June2013)。一些报道提出，降低脂肪细胞的大小能改善脂肪细胞对胰岛素的敏感性5。已经研发用于抑制脂肪积聚的众多基于小分子的口服递送药物并上市。然而，口服施用这些类型的制剂伴随副作用。在这类应用中，局部制剂应该更有效，还将提供靶向身体的脂肪积聚问题区域的优势，以及其他优势。在局部制剂中使用多肽的众多障碍之一还是这些多肽和蛋白分子的尺寸和庞大体积，由于皮肤组织的结构，这些多肽无法充分渗透皮肤以便在身体内提供有益的药学和生理学效果。针对该问题的常规方法已采用了微观治疗装置(mesotherapeuticdevices)，如微注射针、电穿孔装置、激光治疗和红外辐射。由于多种原因，这些方法还未提供充分有效和便利的方法来局部施用包含肽的制剂。与足够的保质期和产品生物学稳定性有关的问题也限制了基于多肽/肽/蛋白的局部制剂和其他制剂的应用。医学领域继续存在对具有保持的生物活性和改善的保质期的、经鉴别的基于多肽/蛋白的分子的改良局部制剂的需要。此外，还继续存在对实现有效地递送这些和其他有效多肽/蛋白制剂进入皮肤组织深处从而获得对患者的最大生理益处的需求。本专利技术提供了针对医学邻域这些和其他技术问题的解决方案，将基于多肽和/或蛋白的分子用于局部递送制剂和其他递送制剂应用和治疗方法。专利技术概述本专利技术首次提供了脂质体和纳米脂质体包封的热休克蛋白(HSP)制剂，以及包含HSP的较小多肽片段(即HPf(115个氨基酸)、新的多肽HPfΔC1(101个氨基酸)和HPfΔC2(87个氨基酸))的制剂。所述脂质体制剂还被证明在皮肤表面进行局部递送时具有众多新的和有益的生理效果，包括促进伤口愈合、抑制脂肪细胞分化、改善皮肤状况(包括特应性皮炎、皱纹、皮肤弹性和暗斑，并促进全面皮肤护理)，并有效递送至皮肤毛囊。所述多肽组合物和制剂还可提供为纳米脂质体包封的制剂。这些制剂被证明具有长期的储存稳定性并在溶液中保留生物活性。所述制剂还可提供为适于局部施用、微观治疗施用或系统施用的递送形式。出人意料地，本专利技术采用基于脂质体的递送制剂中的多肽局部制剂，已实现了有效地递送HPf(HSP90a的115个氨基酸的片段)至完整皮肤和受伤皮肤的角质层。根据本专利技术的一些方面，提供了脂质体(尤其是纳米脂质体)包封的多肽组合物，其包含热休克蛋白和HPf多肽或其片段作为活性成分。所述HPf多肽片段可包含具有115个氨基酸的序列(称为HPf)(SEQID.No.1)、101个氨基酸的序列(HPfΔC1)(SEQID.NO.20)、87个氨基酸的序列(HPfΔC2)(SEQI本文档来自技高网...
【技术保护点】
脂质体包封的多肽组合物，其包含HSP90a、HPf多肽、HPfΔC1、HPfΔC2或它们的组合。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.08.09 KR 10-2013-00949301.脂质体包封的多肽组合物，其包含HSP90a、HPf多肽、HPfΔC1、HPfΔC2或它们的组
合。
2.如权利要求1所述的脂质体包封的多肽组合物，其中所述HPf多肽片段是HPfΔC1或
HPfΔC2。
3.如权利要求1所述的脂质体包封的多肽组合物，其中所述脂质体是纳米脂质体，其粒
径为约50-500nm、约50-350nm或约100-250nm。
4.如权利要求1所述的脂质体包封的多肽组合物，其中所述多肽是HSP90a。
5.编码融合蛋白的嵌合构建体，其包含编码HSP90a、HPf多肽、HPfΔC1或HPfΔC2多肽
或其片段的核酸序列，以及编码融合伴侣肽的核酸序列。
6.如权利要求5所述的嵌合构建体，其中所述融合伴侣肽是硫氧还蛋白A、麦芽糖结合
蛋白(MBP)或人生长激素(hGH)。
7.如权利要求6所述的嵌合构建体，其还包含位于编码所述HPf肽的核酸序列和编码所
述融合伴侣肽的核酸序列之间的蛋白切割酶识别位点。
8.如权利要求7所述的嵌合构建体，其中所述蛋白切割酶识别位点是烟草蚀纹病毒
(TEV)蛋白酶识别位点或羟胺识别位点。
9.如权利要求5所述的嵌合构建体，其中所述HPf多肽具有SEQID.NO.l的核酸序列。
10.如权利要求5所述的嵌合构建体，其包含HPfΔC1或HPfΔC2多肽。
11.转化的细胞系，其经转化以表达HPf-融合伴侣嵌合蛋白，所述细胞系包括TOP10细
胞系、RZ4500细胞系、BL21(DE3)pLyS细胞系或RosettaBlue(DE3)细胞系。...
【专利技术属性】
技术研发人员：南基范，李均永，赵永旭，吴达均，
申请(专利权)人：雷杰龙公司，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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