一种检测猪衣原体病的引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测猪衣原体病的引物、试剂盒及方法，所述引物如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示，所述方法是以待检猪样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，电泳鉴定。本发明专利技术的检测猪衣原体病的引物可以特异性地扩增猪鹦鹉热衣原体，对其他常见病原无反应；方法具有很高的灵敏性，可以方便、快捷的对各种临床猪样品的猪鹦鹉热衣原体进行检测，有利于快速制定针对性的防控措施，操作简单、实用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，更具体地，本专利技术涉及一种检测猪衣原体病的引物、试剂盒及方法。
技术介绍
衣原体是介于细菌和病毒之间的一类微生物,直径0.2μm～1.5μm,它只能在寄主细胞原生质内部以一种发育史进行繁殖。此发育史是以小的原体变成较大的网状体为特征的,网状体以分裂方式繁殖,网状体发育成熟后破裂,释放出大量的原体。原体具有感染性,网状体对新的宿主细胞未见感染性。鹦鹉热衣原体革兰氏染色呈阴性。细胞壁的结构和成分与其他革兰氏阴性菌相似,但只有微量或无胞壁酸。猪衣原体病主要是由鹦鹉热衣原体(Chlamydiapsittaci)感染猪引起的一种多征候性传染病,临床表现为怀孕母猪流产、早产和产出生命力弱的仔猪；仔猪肺炎、肠炎、心包炎、脑膜脑炎、多关节炎和结膜炎；公猪睾丸炎等症状。其中猪衣原体性流产和引起仔猪大批死亡的衣原体性肺炎-肠炎对集约化养猪业危害严重。目前对猪衣原体病的诊断方法主要有吉姆萨染色镜检以及鸡胚卵黄囊接种进行病原分离等方法。吉姆萨染色镜检方法受主观影响大，结果偏差大。而病原分离耗时耗力，分离率低。
技术实现思路
基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种猪衣原体病的检测方法，以及该检测方法所使用的引物，该引物可特异性扩增鹦鹉热衣原体，快速对临床样品进行检测。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采取了以下技术方案：一种检测猪衣原体病的引物，所述引物如SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示。上述引物在制备检测猪衣原体病的试剂盒中的应用。一种检测猪衣原体病的试剂盒，所述试剂盒包括上述的检测猪衣原体病的引物。一种检测猪衣原体病的方法，采用上述引物，包括以下步骤：以待检猪样本基因组DNA为模板，进行PCR扩增反应，电泳鉴定；所述PCR扩增反应的反应体系为：所述PCR扩增反应的反应程序为：94℃5min进行预变性；然后94℃30s，52℃30s，72℃50s，共进行35次循环；最后72℃延伸10min。与现有技术相比，本专利技术具有以下显著效果：1、本专利技术的检测猪衣原体病的引物可以特异性地扩增猪鹦鹉热衣原体，对其他常见病原如猪弓形虫、猪附红细胞体、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等无反应；2、本专利技术的检测猪衣原体病的方法具有很高的灵敏性，灵敏度可达25ng左右，可以方便、快捷的对各种临床猪样品的猪鹦鹉热衣原体进行检测，有利于快速制定针对性的防控措施，操作简单、实用。附图说明图1为本专利技术实施例1中猪衣原体病临床样品检测图谱，其中泳道1为猪鹦鹉热衣原体阳性对照，泳道2为猪鹦鹉热衣原体阴性对照，泳道3、4、5、6为临床样品；图2为本专利技术试验例1中猪鹦鹉热衣原体的PCR检测方法的特异性的电泳图谱，其中：泳道1为猪鹦鹉热衣原体阳性样品，泳道2为猪鹦鹉热衣原体阴性样品，泳道3-8分别为猪弓形虫、猪附红细胞体、猪肺炎支原体、猪多杀性巴氏杆菌、猪链球菌、猪胸膜肺炎放线杆菌样品；图3为本专利技术试验例2中猪衣原体病的PCR检测方法的灵敏度的电泳图谱，其中泳道1、2、3、4、5、6、7的DNA浓度分别为2.48μg、0.248μg、24.8ng、2.48ng、0.248ng、0.0248ng、2.48pg。具体实施方式以下结合附图和具体实施例来详细说明本专利技术。以下实施例中涉及的实验材料如无特殊说明，均来源于市售，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。实施例1检测猪衣原体病的引物和方法1、引物设计根据NCBI登录的猪鹦鹉热衣原体MOMP(majoroutermembraneprotein)基因序列(登录号：AB468956，KM609426，CP003790，EU856033，CP002807，CP002805，CP002586，FQ482149)进行比对，并设计了猪鹦鹉热衣原体PCR引物，分别为F1、R1。F1:TCCTTACAAGCCTTGCCTGTAGG(SEQIDNO:1)R1:AGCGTATTGGAAYTCRGCTC(SEQIDNO:2)其中，兼并碱基代码：Y＝C/T，R＝A/G2、检测方法包括以下步骤：(1)、待检猪样本基因组DNA提取采用爱思进生物技术(杭州)有限公司DNA/RNA小量试剂盒。100mg新鲜流产胎儿肺脏(编号3)、淋巴结(编号4)、流产母猪阴道分泌物(编号5)，患多发性关节炎仔猪的关节囊液(编号6)。加入1mLPBS缓冲液进行充分研磨,-20℃反复冻融3次,8000rpm离心10min，取上清液200μL，转入1.5mL离心管中。加200μLBufferV-L，漩涡振荡混合均匀，静置5min。加75μLBufferV-N，漩涡振荡混合均匀，12000g离心5min。将上清转移到新的2mL离心管中，加300μL异丙醇(含1％冰醋酸)，上下倒置6-8次混匀。将制备管置于2ml离心管中，将混合液移入制备管中，6000g离心1min。弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加500μLBufferW1A，室温静置1min。12000g离心1min。弃滤液，将制备管置回到2mL离心管中，加800μLBufferW2，12000g离心1min。将制备管置回到2mL离心管中，12000g离心1min。将制备管置于洁净的1.5mL离心管中，在制备管膜中央加入40μLBufferTE，室温静置1min。12000g离心1min，离心下来的溶液即为基因组DNA模板。(2)、PCR扩增将PCR反应液加入PCR反应管混合均匀后，加入基因组DNA模板，将PCR管置于PCR仪上进行循环扩增反应；PCR反应体系如下，其中PremixEXTaq是PCR反应用的DNAPolymerase、Buffer、dNTPMixture的2倍浓度的混合物，包含DNAPolymerase1.25U/25μL、Buffer(Tris-HCl,pH8.320mM，KCl100mM，MgCl23mM)、dNTPMixture各0.4mM：所述PCR扩增反应的反应程序为：94℃5min进行预变性；然后94℃30s，52℃30s，72℃50s，共进行35次循环；最后72℃延伸10min。(3)、电泳鉴定PCR扩增后取5μL反应产物，在1％(质量比)的琼脂糖凝胶上进行电泳鉴定，PCR产物出现609bp条带，即为猪鹦鹉热衣原体阳性，无条带出现的为阴性，本实施例的猪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测猪衣原体病的引物，其特征在于，所述引物如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示。

【技术特征摘要】
1.一种检测猪衣原体病的引物，其特征在于，所述引物如SEQIDNo:1和
SEQIDNo:2所示。
2.权利要求1所述的引物在制备检测猪衣原体病的试剂盒中的应用。
3.一种检测猪衣原体病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求
1所述的检测猪衣原体病的引物。
4.一种检测猪衣原体病的方法，其特征在于，采用如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳海平，宋爽，潘永飞，王东东，蔡新斌，宋延华，
申请(专利权)人：广东温氏食品集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44