一种PCR热启动方法技术

本发明专利技术公布了一种PCR热启动方法，在缓冲液中扩增核酸，所述缓冲液包括20‑100mM温度敏感的pH缓冲剂；2.5‑50mM pH敏感的镁离子络合剂；2‑30mM水溶性镁盐；20‑100mM单价盐。本发明专利技术的PCR热启动方法及其相应的PCR缓冲液能够显著降低PCR扩增时的非特异性扩增，显著提高PCR的特异性扩增的效率，同时能克服多种多价金属离子对PCR扩增的抑制作用，改善对来源于复杂环境的DNA模板的PCR扩增结果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种PCR热启动方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(PCR)技术是现代生物医学领域的核心技术，在基础研究、生物技术、临床诊断等领域都发挥巨大的作用。之前的研究发现，PCR反应时，除了特异的目的片段被扩增外，非特异扩增反应也常常会发生，严重时甚至抑制特异性扩增反应的发生。对于困难的目的片段，比如高GC含量，容易形成二级结构以及非常长的目的片段的扩增更加容易受到非特异性扩增的影响。因此，采用各种措施提高扩增反应的特异性对于PCR技术成功运用就变得非常关键了。除了改进引物的设计、优化退火温度或在反应液中加入各种添加剂等众所周知的办法来提高特异性退火的效率从而提高扩增反应的特异性外，采用热启动的办法也是非常有效的。早期的研究发现，由于在配制PCR反应液时，即使反应液放置在冰上，残留的聚合酶活性仍然会导致非特异性反应的发生。目前，已有很多的方法用于实现PCR的热启动，比如手动的热启动，使用抗体或其他可抑制聚合酶的活性的亲和配体，对聚合酶进行多种化学修饰，对引物进行化学修饰，对PCR反应的必需底物dNTP进行化学修饰，用定向进化对聚合酶进行改造，使之变得冷敏感，使用单链结合蛋白与聚合酶重组而成融合的聚合酶等等。这些方法，普遍的缺点是成本很高，用于实现热启动的成本大大超出了PCR本身的成本。其次，除了对PCR反应的必需底物dNTP进行化学修饰的方法外，其他方法只对一种酶甚至单一反应(对引物进行化学修饰)有效，因此适用范围很窄。除了普遍的缺点，不同的方法在实际应用方面还有各自的缺点，比如抗体法中用的抗体在运输、反复冻融及长期储存过程中容易失活。化学修饰的办法，无论对酶、对引物还是dNTP进行修饰，往往都要额外的热激活时间。实际上，之前也有少数的研究尝试通过控制自由镁离子的浓度来实现PCR的热启动，至少从表面上看，这一思路非常有吸引力的。目前，现有技术中通过磷酸根、草酸根控制自由镁离子的浓度来实现PCR的热启动。这两种方法都是通过形成镁离子的沉淀，利用沉淀的镁离子复合物在低温时溶解度较低而抑制聚合酶的活性，高温时溶解度较高而提供较多的自由镁离子并激活聚合酶。但这两个原理类似的专利的方法都有重要的缺陷。由于沉淀需要预先形成，但又不能长时间放置以免形成较大的沉淀而影响镁离子的均匀分布，所以这两个专利的方法不仅需要新鲜配制镁离子沉淀物，操作比较繁琐，很难与高通量的PCR反应兼容。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种廉价高效的可减少非特异性扩增的PCR热启动方法。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种PCR热启动方法，其特征在于：在缓冲液中扩增核酸，所述缓冲液包括20-100mM温度敏感的pH缓冲剂；2.5-50mMpH敏感的镁离子络合剂；2-30mM水溶性镁盐；20-100mM单价盐。进一步地，所述单价盐包括钠盐，钾盐和铵盐。进一步地，所述缓冲液包括50mM温度敏感的pH缓冲剂；50mMpH敏感的镁离子络合剂；25mM水溶性镁盐；50mM单价盐。进一步地，所述pH敏感的镁离子络合剂与水溶性镁盐的摩尔比为1-1.5:1。进一步地，所述温度敏感的pH缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷，N-三(羟甲基)甲基甘氨酸，双(2-羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷和1,3-双(三羟甲基)甲基氨基丙烷的一种或多种的混合物。进一步地，所述温度敏感的pH缓冲剂为在温度上升10℃时，其pKa值下降超过0.15。进一步地，所述pH敏感的镁离子络合剂为EDTA，EGTA和BTPA的一种或多种的混合物。进一步地，所述水溶性镁盐为氯化镁，硫酸镁和醋酸镁中的一种或多种的混合物。本专利技术的PCR热启动方法，由于缓冲液中的pH敏感的镁离子络合剂和温度敏感的pH缓冲剂，在进行PCR热启动时，常温时反应液中大多数镁离子被高效络合而保持非常低的自由镁离子浓度，在高温条件下，温度敏感的缓冲液成分释放出大量的氢离子(H+)，在降低pH值的同时竞争性抑制了该类络合剂对镁离子的络合能力。因而在常温下与络合剂结合的镁离子大量释放出来并激活聚合酶从而实现PCR的热启动。本专利技术背后的关键原理是：PCR反应液中含有一种在适当pH范围内(6.0-10.0)对pH变化非常敏感的镁离子络合剂，另外含有一种对温度非常敏感的pH缓冲试剂。在温度较低时(约0-25℃)，pH值较高，这时镁离子络合剂对镁离子的络合作用较强，溶液中自由的镁离子浓度很低，依赖于镁离子的聚合酶的活性也就非常低。当PCR的热循环的到达较高的温度，由于温度的升高，对温度敏感的pH缓冲试剂释放出较多的氢离子，竞争性与镁离子络合剂结合，因而使之释放出较多的自由镁离子从而激活聚合酶的活性。本专利技术还给出了镁离子和pH敏感的镁离子络合剂的最佳配比，在最佳配比下，能够显著降低PCR扩增时的非特异扩增，特异性扩增效率也显著提高，同时能缓解重金属离子对PCR扩增的抑制作用，能够实现对复杂环境的DNA模板的扩增。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为不同的Mg++浓度与某固定浓度的pH敏感的镁离子络合剂配合使用时热启动的效果，目的片段是容易发生非特异扩增的人actin基因的一个扩增子，M.DL5000DNAMarker；图2的上面一版是进一步优化最佳Mg++浓度，Mg++的增量为0.25mM，下面一版为PCR反应液在配制后立即进行PCR热循环(奇数泳道)或在常温(25度)孵育15分钟后再进行PCR热循环(偶数泳道)，显示了本方法的在不利条件下的热启动效果。目的片段是容易发生非特异扩增的人actin基因的一个扩增子，M.DL5000DNAMarker；图3为使用本专利技术的PCR缓冲液对已知的多个容易发生非特异性扩增的目的基因进行PCR扩增的效果与非热启动方法，抗体法及化学修饰法的比较，M.DL5000DNAMarker；图4为使用本专利技术的PCR缓冲液可支持较长目的片段的PCR扩增，M.DL5000DNAMarker；图5为使用本专利技术的PCR缓冲液能克服多种金属离子对PCR的抑制作用，M.DL5000DNAMarker。具体实施方式下面将结合本专利技术的实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例，仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种PCR热启动方法，在缓冲液中扩增核酸，所述缓冲液包括20-100mM温度敏感的pH缓冲剂；1-50mMpH敏感的镁离子络合剂；1-30mM水溶性镁盐；20-100mM单价盐。上述为缓冲液在反应体系中各组分的终浓度，在实际使用时可预先配制成2×缓冲液，4×缓冲液，5×缓冲液、6×缓冲液，10×缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种PCR热启动方法，其特征在于：在缓冲液中扩增核酸，所述缓冲液包括20‑100mM温度敏感的pH缓冲剂；2.5‑50mM pH敏感的镁离子络合剂；2‑30mM水溶性镁盐；20‑100mM单价盐。

【技术特征摘要】
1.一种PCR热启动方法，其特征在于：在缓冲液中扩增核酸，所述缓冲液
包括20-100mM温度敏感的pH缓冲剂；2.5-50mMpH敏感的镁离子络合剂；
2-30mM水溶性镁盐；20-100mM单价盐。
2.根据权利要求1所述的PCR热启动方法，其特征在于：所述缓冲液包括
50mM温度敏感的pH缓冲剂；5mMpH敏感的镁离子络合剂；4mM水溶性镁
盐；50mM单价盐。
3.根据权利要求1所述的PCR热启动方法，其特征在于：所述pH敏感的
镁离子络合剂与水溶性镁盐的摩尔比为1-1.5:1。
4.根据权利要求1或2所述的PCR热启动方法，其特征在于：所述温度敏
感的pH缓冲剂包括三羟甲基氨基甲烷，N-三(羟甲基)甲基甘氨酸，双...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶忠，曾伟平，
申请(专利权)人：江西中大赛尔生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36