一种铜绿假单胞菌基因及其DNA疫苗制造技术

本发明专利技术公开一种铜绿假单胞菌OprF‑VP22基因，以及该基因作为制造防治铜绿假单胞菌感染疫苗的用途，以及一种含有该基因的铜绿假单胞菌DNA疫苗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学和感染免疫领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌OprF-VP22基因和含有该基因的DNA疫苗。
技术介绍
铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，种Pa)又称绿脓杆菌，假单胞杆菌属，是一种专性需氧的革兰氏阴性菌，广泛分布于自然界，土壤、水、空气，正常人的皮肤、呼吸道和肠道等都有该菌存在。该菌是一种条件致病菌，机体在某些条件下，如抵抗力降低，被严重烧伤或患代谢性疾病、血液病、恶性肿瘤，以及术后或某些治疗后容易感染该菌。铜绿假单胞菌是院内获得性感染的重要致病菌，我国全国性监测数据显示：从1994年到2006年，铜绿假单胞菌在所有院内感染的革兰氏阴性菌中排第1位；2008年9月至2011年8月住院患者标本中分离出的革兰氏阴性杆菌进行分析发现，铜绿假单胞菌连续3年名列第1，并成为呼吸机相关性肺炎的首位致病菌。随着抗生素不合理的应用，该菌对抗菌药的耐药性呈现逐年上升的趋势，并且开始产生对3类或3类以上抗菌药均表现耐药的多重耐药，甚至泛耐药的现象。Pa因耐药率高导致抗菌药物治疗困难的现状已成为目前国内外临床抗感染治疗的棘手问题，2012年的中国CHINET细菌耐药性检测结果显示：除阿米卡星和多粘菌素B以外，铜绿假单胞菌对其他临床常用的抗菌药物耐药率为17％-35％，其中对美罗培南和亚胺培南的耐药率高达27.1％和29.0％，与10年前相比有了明显的上升。铜绿假单胞菌存在天然耐药、获得性耐药及适应性耐药等复杂的耐药机制。鉴于Pa日益严重的耐药现状，迫使我们急切需要寻求抗菌药物之外的其他手段来治疗和预防Pa感染。免疫预防一直都是人们防治疾病的一个重要手段，因此研究有效的疫苗成为防治Pa感染的重要策略之一。随着分子生物技术及基因工程技术的发展，DNA疫苗逐渐成为人们关注的焦点。DNA疫苗，又称核酸疫苗或基因疫苗，是把编码目的抗原基因序列的真核表达质粒DNA，经过一定的途径导入人或动物体内，通过宿主细胞的转录翻译系统，在体内表达出抗原蛋白，从而刺激机体产生免疫应答起到免疫保护的作用。作为新一代的疫苗形式，与传统疫苗相比,DNA疫苗具有许多潜在的优势：如制备简单,成本低廉,易于大规模生产；可以制成冻干疫苗，便于保存和运输；既能介导体液免疫又能介导细胞免疫，可以将多种质粒DNA组成多价疫苗等。关于Pa疫苗的研究已有半个多世纪的历史，对Pa疫苗的研究大致经历了灭活与减毒活疫苗→结合疫苗→基因工程疫苗几个阶段，做为一种新型的基因工程疫苗，迄今铜绿假单胞菌DNA疫苗尚处于动物实验研究阶段，虽取得了一定进展，但在研究中发现，DNA疫苗普遍存在免疫效力较低的缺点，即使以免疫原性较强的外膜蛋白F(theoutermembraneproteinF，OprF)为抗原的DNA疫苗仍然存在这样的问题。因此，至今还没有一种能真正有效防治Pa感染的DNA疫苗问世。具有蛋白转导功能的细胞穿透肽(cellpenetratingpeptide,CPP)逐渐成为科研者关注和研究的对象，CPP是一类能够顺利通过生物膜进入细胞的多肽，能够携带不同种类的外源物质，包括蛋白质、核酸及多肽等大分子物质通过生物膜和生理屏障(包括血脑屏障和胎盘屏障)进入细胞，并且不受细胞类型的限制，在体内外均能发挥作用。I型单纯疱疹病毒间层蛋白VP22已被证实是一种含有CPP结构的蛋白质，在α疱疹病毒中有较高的同源性。VP22具有高效的细胞间转导功能,能够在没有媒介物或受体的情况下携带外源物质跨越生物膜质结构进入细胞，并介导被转运物质从转染细胞传递至邻近细胞，且保留转运物质的生物学活性和功能。VP22与抗原DNA融合的VP22-DNA疫苗有着较大的研究价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种铜绿假单胞菌外膜蛋白F与I型单纯疱疹病毒间层蛋白VP22融合表达的铜绿假单胞菌OprF-VP22基因及其DNA疫苗。该基因编码的蛋白质可有效地穿透细胞膜，可以促进抗原蛋白OprF进入细胞,从而提高抗原递呈细胞提呈抗原蛋白的能力，进而增强DNA疫苗的免疫效力。本专利技术的一种铜绿假单胞菌OprF-VP22基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的一种铜绿假单胞菌OprF-VP22基因在制备铜绿假单胞菌疫苗中的用途。本专利技术的目的还在于提供一种铜绿假单胞菌DNA疫苗，包含铜绿假单胞菌OprF-VP22基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。上述本专利技术的DNA疫苗，所述基因构建于表达载体上，所述所述表达载体为pVAX-1。本专利技术的有益效果如下：1.以铜绿假单胞菌PAO1为模板扩增OprF基因，以pcDNA3-VP22为模板扩增VP22基因，以FDA批准人DNA疫苗质粒pVAX1为载体，采用OverlappingPCR方法获得DNA疫苗pVAX1-OprF-VP22。2.酶联免疫吸附实验(ELISA)间接法确证pVAX1-OprF-VP22免疫BALB/c小鼠的抗体效价高于pVAX1-OprF免疫BALB/c小鼠，说明pVAX1-OprF-VP22增强了OprFDNA疫苗的体液免疫效力。3.T淋巴细胞增殖实验和IFN-γ酶联免疫斑点法确证pVAX1-OprF-VP22免疫BALB/c小鼠T淋巴细胞的增殖能力与T淋巴细胞分泌IFN-γ的能力均高于pVAX1-OprF免疫BALB/c小鼠，说明pVAX1-OprF-VP22增强了OprFDNA疫苗的细胞免疫效力。4.pVAX1-OprF-VP22对BALB/c小鼠铜绿假单胞菌肺部感染模型的保护作用强于pVAX1-OprF免疫小鼠，说明pVAX1-OprF-VP22增强了OprFDNA疫苗的动物免疫保护作用。附图说明图1是pVAX1-OprF-VP22DNA疫苗的酶切鉴定结果，其中图中1泳道为pVAX1-OprF-VP22DNA疫苗，2泳道为pVAX1-OprF-VP22BamHI和EcoRI双酶切产物，M泳道为核酸分子量标准图2为小鼠血清OprF抗体效价盒形图。具体实施方式以下实施例用于进一步理解和说明本专利技术质，但不以任何方式限制本专利技术的范围。实施例1pVAX1-OprF-VP22构建方法采用overlappingPCR的方式构建铜绿假单胞菌DNA疫苗pVAX1-OprF-VP221、PCR扩增OprF基因：按北京天根生物有限公司细菌基因组提取试剂盒说明书,从铜绿假单胞菌PAO1提取铜绿假单胞菌基因组，再本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种铜绿假单胞菌OprF‑VP22基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种铜绿假单胞菌OprF-VP22基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
2.权利要求1的OprF-VP22基因在制备铜绿假单胞菌疫苗中的用途。
3.一种铜绿假单胞菌DNA疫苗，包含铜绿...

【专利技术属性】
技术研发人员：余娴，赵春景，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：重庆;85