本申请公开了测定刺激细胞因子风暴反应的体外方法，其包括以下步骤：a.共培养PBMC和匹配的分化的内皮细胞，以提供代表人体内反应的系统，和b.将所述共培养的细胞系统暴露于测试试剂，c.分析所述系统中存在的在所述共培养的系统暴露于所述测试试剂之后释放的一种或多种细胞因子，以及d.任选地，与对一种或多种对照试剂的反应相比较，评估对所述测试试剂的反应。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 本公开设及体外预测测试化合物，特别是推定的生物治疗剂，在人类患者中引起 不利的细胞因子反应和/或细胞因子风暴反应(storm response,又被称为CRS)的潜力的改 进方法。 2006年3月，在诺斯威奇帕克（Northwick Park)医院进行的设及生物治疗药剂 TGN1412的健康人类志愿者试验中出现了严重的不良事件。试验的至少6名志愿者由于给予 治疗剂之后的不良事件而住院，其中大部分具有多器官功能障碍。 据报道，运些志愿者经历了导致血管性水肿、皮肤和黏膜肿胀的细胞因子释放综 合征(又被称为细胞因子风暴和细胞因子释放综合征），类似于严重过敏反应中的补体级联 作用。患者用类固醇来治疗W减轻炎症，并更换血浆试图从其循环中去除TGN1412。后来证 实，运些志愿者经历了细胞因子风暴，并且自相矛盾的是，在给予TGN1412之后几小时，他们 的白细胞几乎完全消失。 TGN1412在向人类给药之前已在动物中进行了试验。然而，认为在相关方面，治疗 剂在人中引发不同于试验动物的反应。已推测在人中观测到的反应仅在具有记忆T细胞的 动物中出现。然而在实验室条件"无菌条件"下饲养的动物基本上都没有记忆T细胞，因而未 引发相同的反应。现在来看，在实验室研究中所使用的动物种类几乎没有记忆T细胞，因而 未引发相同的反应，如此例如，小鼠似乎没有引发细胞因子风暴反应。还在分离的人类T细 胞和灵长类动物上测试了 TGN1412,并未暗示随后在人类中观测到的问题。然而，我们现在 知道TGN1412需要内皮细胞(或其它)界面W活化免疫细胞(参见下文）。 细胞因子风暴系由免疫(或其它）细胞释放的细胞因子变得过度并损伤了组织和 器官。在一些患者中，反应如此严重从而导致死亡。 每一血管腔表面内衬的内皮层是首先接触活化的循环白细胞的细胞。内皮层与白 细胞之间的相互作用可导致炎性反应深度放大。Ste化ings等1的开拓性研究表明，为了从 人外周血单核细胞(PBMC)体外观测抗-CD28超级激动剂TGN1412的细胞因子反应，该现象是 必须的。 目前存在数量有限的体外测定法可检测细胞因子对诸如TGN1412的抗-CD28超级 激动剂的反应。运些测定法使用细胞组分的混合物，包括：[000引 ?厮静脉内皮细胞化UVEC)和PBMCi， ?在被添加至PBMC之前，在塑料平板上1或合成微珠上2固定的抗体（固定;例如，通 过使抗体的水溶液蒸发，留下抗体/药物粘附于表面结构），或 .人全血的培养物3。 显然，人组织生物测定法需要细胞组分的混合物，如由W下发现所证明：TGN1412 和相关分子并不活化分离的PBMC或HUVEC制备物，但是当PBMC和HUVEC在一起培养时 TGN1412引起强烈的细胞因子反应I'3'4。然而，本专利技术人认为，运种类型的生物测定法及其他 文献报道的生物测定法有重大缺陷，因为它们依赖于混合来自一个供体的内皮细胞（在 皿VEC的情况下;胎儿细胞)和另一供体的PBMC。此外，常规混合的组织生物测定法并未适当 地描绘在某些情况下一些细胞因子 34抗体如TGN1412具有深度细胞因子风暴效应，而一些 细胞因子抗体如Campath引起严重但是更溫和且可控制的反应。因而，现有技术中基于细胞 的测定法获得的结果未充分反映出同一治疗剂在体内反应中观测到的相同趋势。 运一问题在最近Findlay等人4的文章中进行了研究，其认为"PBMC.册VEC共培养 物并未完全反映出所报道的体内测量结果或体外固定的TGN1412刺激释放，表明存在触发 释放不同细胞因子的释放的替代刺激机制"（第142页第1栏第一段）。 Findlay等人接着推测运可能是由于W下一种或多种： l."HUVEC与衰老密切相关且分离自缺氧血管。因而，它们不可能提供内皮相互作 用的最佳模型。此外，来自不同器官和血管的内皮细胞显示值得注意的异质性，并且册VEC 可能不具有最大化共刺激所必需的组织特异性特征，例如，介导体内T细胞的粘附和迁移的 高内皮微静脉。 2.最大化刺激需要除了在HUVEC培养物中存在的那些之外的细胞类型。 3.共培养物中IL-2的低水平产生导致驱动T细胞增殖的连续消耗，反之在固定化 测定中，更高水平的产生导致饱和水平且在上清液中积聚。 4.与共培养相比，在固定化测定中最有可能存在不同的细胞因子释放机制，可能 设及不同的T细胞亚群，并且加之在共培养中，化-6、IL-8和TN化的释放通过与释放IL-2和 IFN 丫不同的机制发生，如对TN阳反应通过HUVEC产生IL-6。" 第2点在随后的文章中进行了研究。本领域技术人员自2006年就试图解决运一问 题，至今仍未找到通用的可预测体内结果的合适的标准测定法。 运在测试用于可能的治疗剂的能力留下了空白。因而，当前急切的未满足的需求 是开发合适的人组织试验测定法，其将例如，预测由诸如TGN1412 6的生物治疗剂诱导的细 胞因子风暴，和/或测试开发新的药物或小分子W及基于与免疫途径相互作用的蛋白或干 细胞的疗法的功效。 本专利技术人已发现改进的测定法，其似乎提供了类似于在给予TGN1412的人类中观 测到的结果，因而满足了安全性测试领域未满足的重大需求，特别是生物药物。与目前现有 的测定法不同，本专利技术还允许直接检测与体内临床表现有关的细胞群，即来自患者目标群 体的内皮和PBMC。 虽然现有技术测定法可用于验证对TGN1412的细胞因子信号，但是本专利技术人推测 由于现有技术测定法使用来自不匹配供体的细胞，它们易于产生假阳性反应和假阴性反 应。后者可能由混合来自不匹配供体的组织造成，运可活化/抑制每一个体供体的天然免疫 反应。运可通过本专利技术人近期数据来说明，该数据表明在全血/册VEC混合的组织生物测定 中使用至少10%的供体血液观测到深度炎性活化 3。 确实不可能将册VEC细胞与在测定中使用的诸如PBMC的其它组织相匹配，因此需 要替代系统。 专利技术简述 本公开提供了测定刺激细胞因子风暴反应的体外方法，其包括W下步骤： a.共培养PBMC和匹配的分化的内皮细胞，W提供代表人体内反应的系统，和 b.将所述共培养的细胞系统暴露于测试试剂， C.分析所述系统中存在的在所述共培养系统暴露于所述测试试剂之后释放的一 种或多种细胞因子，W及 任选地，与对一种或多种对照试剂的反应相比较，评估对所述测试试剂的反应。 本专利技术人已确定了用于本文所公开的测定法的B0EC(外周血来源的过度生长内皮 细胞)可由血样制备，且PBMC也可由例如同一样品（或来自同一供体的另一血样)制备。 有利地，本专利技术人已发现本测定系统可预测体内反应，并且可能是研究和药物安 全性评估的有力工具。在与用当前产业标准测定法，其利用不匹配的HUVEC和PBMC共培养物 或人全血，的比较研究中，本专利技术人发现本公开的测定法更精确地预测了引起细胞因子风 暴反应的某些药物的"等级次序"。 本专利技术人之前还表明，与B0EC形成对比，源自其他类型干细胞的内皮细胞（即胚胎 干细胞来源的内皮细胞;hESC-EC)具有深度妥协免疫反应 8，运使它们不适合于任何类型的 基于体外细胞测定来预测细胞因子风暴反应。 重要地，对于安全给予患者且不会诱导细胞因子风暴的阴性对照抗体，本公开的 生本文档来自技高网...
【技术保护点】
测定刺激细胞因子风暴反应的体外方法，其包括以下步骤：a.共培养PBMC和匹配的分化的内皮细胞，以提供代表人体内反应的系统，和b.将所述共培养的细胞系统暴露于测试试剂，c.分析所述系统中存在的在所述共培养系统暴露于所述测试试剂之后释放的一种或多种细胞因子，以及d.任选地，与对一种或多种对照试剂的反应相比较，评估对所述测试试剂的反应。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：简·艾丽森·米切尔，
申请(专利权)人：皇家创新有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB
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