用于治疗肌营养不良的外显子跳跃组合物制造技术

本发明专利技术描述了能够结合在人类抗肌营养不良蛋白基因中的选定的靶标位点以诱发外显子44跳跃的反义分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗肌营养不良的外显子跳跃组合物相关申请本专利申请要求2013年3月14日提交的美国临时专利申请序列号61/784547的权益。以上提到的临时专利申请的全部内容通过引用结合到本文中。专利
本专利技术涉及适合促进在人类抗肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃的新反义化合物和组合物。还提供了使用适用于本专利技术方法的新反义组合物诱发外显子跳跃的方法。专利技术背景反义技术正使用各种化学发展以实现各种不同的水平的基因表达(转录、剪接、稳定、翻译)。大量研究集中在使用反义化合物来矫正或补偿在广泛的适应症中的异常或疾病相关的基因。反义分子能够特异性地抑制基因表达，并且因为此，考虑寡核苷酸作为基因表达的调节剂的许多研究工作集中在抑制靶向基因的表达或顺式作用元件的功能。反义寡核苷酸通常指向RNA，即有义链(例如，mRNA)或在一些病毒RNA靶标的情况下负链。为了实现特异性基因下调的期望效果，寡核苷酸通常促进靶向mRNA的衰变、阻断mRNA的翻译或阻断顺式作用RNA元件的功能，由此有效地防止靶标蛋白质的从头合成或病毒RNA的复制。然而，在旨在上调天然蛋白质的产生或补偿诱发翻译的过早终止的突变如无义或移码突变的情况下，这样的技术是不可用的。在这些情况下，缺陷型基因转录体将不会经历靶向降解或空间抑制，因此反义寡核苷酸化学将不会促进靶标mRNA衰变或阻断翻译。在多种遗传性疾病中，突变对于基因的最后表达的影响可经由在剪接过程期间靶向外显子跳跃的过程调节。该剪接过程通过复杂的多组分机制引导，所述机制使在前-mRNA中的邻近外显子-内含子接点紧靠着并执行在内含子的末端的磷酸二酯键的裂解，其随后在将一起剪接的外显子之间再形成。该复杂且高度精确的过程由在前-mRNA中的序列基序介导，这些序列基序为相对较短的半保守RNA区段，随后在剪接反应中涉及的各种核剪接因子与其结合。通过改变剪接机制读取或识别在前-mRNA加工中涉及的基序的方式，可以产生区别性剪接的mRNA分子。现在已经认识到大多数人类基因在正常基因表达期间选择性剪接，不过尚未鉴定出所涉及的机理。Bennett等(美国专利6,210,892号)描述使用不诱发靶标RNA的RNA酶H-介导的裂解的反义寡核苷酸类似物，反义调节野生型细胞mRNA加工。其用处在于能够产生缺乏特异性外显子的选择性剪接的mRNA(例如，如(sazani,kole等，2007)描述，从而产生缺乏编码跨膜域的外显子的可溶性TNF超家族受体。在正常功能蛋白由于其中的突变而过早地终止的情况下，已经显示经由反义技术修复一些功能蛋白产生的方法可以经由在剪接过程期间的干预进行，并且如果与引起疾病的突变相关的外显子可从一些基因上特异性地缺失，则有时可生成缩短的蛋白质产物，其具有与天然蛋白质类似的生物性质或者具有足以改善由与该外显子相关的突变引起的疾病的生物活性(参见，例如Sierakowska,Sambade等，1996；Wilton,Lloyd等，1999；vanDeutekom,Bremmer-Bout等，2001；Lu,Mann等，2003；Aartsma-Rus,Janson等，2004)。Kole等(美国专利号5,627,274、5,916,808、5,976,879和5,665,593)公开了使用不促进靶向的前-mRNA的衰变的修饰的反义寡核苷酸类似物防止异常剪接的方法。Bennett等(美国专利号6,210,892)描述还使用不诱发靶标RNA的RNA酶H-介导的裂解的反义寡核苷酸类似物反义调节野生型细胞mRNA加工。靶向外显子跳跃的方法可能特别可用于长基因中，在这些长基因中，存在许多外显子和内含子，其中在外显子的遗传成分中存在冗余或其中蛋白质能够在没有一个或多个特定外显子的情况下起作用。重新引导基因加工来治疗与由在各种基因中的突变引起的截断相关的遗传性疾病的努力已经集中在使用如下反义寡核苷酸：(1)与在剪接过程中涉及的元件完全或部分地重叠；或(2)在充分靠近该元件的位置处结合前-mRNA以破坏将通常介导在该元件处发生的特定剪接反应的剪接因子的结合和功能。杜兴肌营养不良(DMD)由在蛋白质抗肌营养不良蛋白的表达中的缺陷引起。编码该蛋白质的基因含有散布在DNA的超过两百万个核苷酸上的79个外显子。改变外显子的阅读框或引入终止密码子或以除去整框的一个或多个外显子或复制一个或多个外显子为特征的任何外显子突变具有破坏功能性抗肌营养不良蛋白的产生的潜力，其引起DMD。已经发现在如下情况下发生不太严重形式的肌营养不良：贝克尔肌营养不良(BMD)，其中通常是一个或多个外显子缺失的突变沿整个抗肌营养不良蛋白转录体产生正确阅读框，使得mRNA向蛋白质的翻译未过早地终止。如果在突变的抗肌营养不良蛋白前-mRNA的加工中接合上游外显子和下游外显子维持基因的正确阅读框，则产生保持一定活性的具有短内部缺失的编码蛋白质的mRNA，产生贝克尔表型。多年来已知不改变抗肌营养不良蛋白蛋白质的阅读框的一个或多个外显子的缺失将产生BMD表型，而引起框架移位的外显子缺失将产生DMD(Monaco,Bertelson等，1988)。通常，改变阅读框且因此中断恰当的蛋白质翻译的包括点突变和外显子缺失的抗肌营养不良蛋白突变引起DMD。还应该注意到，一些BMD和DMD患者具有涵盖多个外显子的外显子缺失。已经报道了体外和体内用反义寡核糖核苷酸剪接突变体抗肌营养不良蛋白前-mRNA的调节(参见，例如Matsuo,Masumura等，1991；Takeshima,Nishio等，1995；Pramono,Takeshima等，1996；Dunckley,Eperon等，1997；Dunckley,Manoharan等，1998；Errington,Mann等，2003)。在mdx小鼠模型中特异性且可重现的外显子跳跃的第一实例由Wilton等报道(Wilton,Lloyd等，1999)。通过将反义分子定向到供体剪接位点，在处理培养细胞的6小时内在抗肌营养不良蛋白mRNA中诱发一致且有效的外显子23跳跃。Wilton等还描述了用较长的反义寡核苷酸靶向小鼠抗肌营养不良蛋白前-mRNA的受体区。虽然在内含子23供体剪接位点处定向的第一反义寡核苷酸在原代培养成肌细胞中诱发一致的外显子跳跃，但发现该化合物在表达较高水平的抗肌营养不良蛋白的永生细胞培养物中不太有效。然而，在精细的靶向和反义寡核苷酸设计中，特异性外显子去除的效率增加几乎一个数量级(Mann,Honeyman等，2002)。近来研究已经开始克服实现在受抗肌营养不良蛋白缺乏影响的组织中伴随着最低不良作用的持续抗肌营养不良蛋白表达的挑战。将靶向外显子51(PRO051)的反义寡核苷酸肌肉内注射到四名具有DMD的患者的胫骨前肌肌肉中引起外显子51的特异性跳跃，而没有任何临床上明显的不良作用(Mann,Honeyman等，2002；vanDeutekom,Janson等，2007)。考察在mdx小鼠中与靶向外显子23的细胞穿透肽(PPMO)缀合的反义二氨基磷酸吗啉寡聚体的全身性递送的研究在骨骼和心肌中实现高且持续的抗肌营养不良蛋白蛋白质产生，而没有可检测的毒性(Jearawiriyapaisarn,Moulton等，200本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够结合选定的靶标以诱发在人类抗肌营养不良蛋白基因中的外显子跳跃的长度为20‑50个核苷酸的反义寡聚体，其中所述反义寡聚体包含特异性杂交至选自H44A(‑07+15)、H44A(‑08+15)、H44A(‑06+15)、H44A(‑08+17)、H44A(‑07+17)和H44A(‑06+17)的外显子44靶标区的碱基序列，其中所述寡聚体的碱基连接吗啉环结构，且其中所述吗啉环结构通过接合一个环结构的吗啉氮到邻近环结构的5'外环碳的含磷亚基间键接合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.03.14 US 61/7845471.由与人类抗肌营养不良蛋白前-mRNA的外显子44靶标区100%互补的碱基序列组成的22个碱基的反义寡核苷酸或其药学上可接受的盐，其中所述靶标区为退火位点H44A(-07+15)，其中所述反义寡核苷酸为吗啉反义寡核苷酸，且其中所述反义寡核苷酸诱发外显子44跳跃；其中所述吗啉反义寡核苷酸的碱基连接到吗啉环结构，且其中所述吗啉环结构通过接合一个环结构的吗啉氮到邻近环结构的5'外环碳的含磷亚基间键接合，其中所述碱基序列为GATCTGTCAAATCG...

【专利技术属性】
技术研发人员：RK贝斯特维克，DE弗兰克，
申请(专利权)人：萨勒普塔医疗公司，
类型：发明
国别省市：美国;US