利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括：(1)将能够直接在未脱毒的甘蔗渣水解液中生长的裂殖壶菌菌株培养，得到种子液；(2)将所述种子液接种至利用所述未脱毒的甘蔗渣水解液制成的发酵培养液中，发酵培养，得到二十二碳六烯酸。本发明专利技术的生产裂殖壶菌的方法成本低，易控制，裂殖壶菌产量高且DHA含量高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生产二十二碳六烯酸的方法，特别是利用裂殖壶菌生产二十二碳 六烯酸的方法。
技术介绍
二十二碳六烯酸（DHA，C22:6n_3)是一种对人体健康非常有益的ω-3族脂肪酸。 人类的大脑皮层、视网膜、睾丸以及精子中DHA含量特别丰富，DHA是大脑结构脂肪酸不可 或缺的成分之一。DHA对治疗动脉粥样硬化、高甘油三酯血症、高血压和癌症有非常良好的 效果，对婴幼儿智力及视力的发育起着重要的作用，DHA还具有预防冠心病，降低心脏病患 者猝死几率，预防老年痴呆和延缓衰老等作用。人类由于缺少合成ω-3族脂肪酸所需的 酶，不能自身合成DHA，只能从食物中摄取。此外，动物卵细胞和精子中富含DHA，DHA在细胞 结构、物质代谢和能量代谢等起非常重要的作用，它能够促进动物生长，增强动物免疫力， 因而，DHA在饲料行业也有广泛的应用，将富含DHA的油脂或微生物菌体作添加剂加入到饲 料中具有重要的意义。传统上DHA从深海鱼油中提取，受鱼的品种、季节、地理位置的影响 而不稳定，且鱼油中还富含胆固醇和其他不饱和脂肪酸成分，导致DHA提取纯化成本较高， 产量也有限。 裂殖壶菌（Schizochytriumsp.)又称裂壶藻，能够合成DHA，由于其繁殖方式为 裂殖，生长周期短，且细胞内脂肪酸和DHA含量高等优势，被认为是生产DHA较理想的菌种。 裂殖壶菌属于异养微生物，目前的菌体培养多采用有机氮源和碳源，例如鱼蛋白胨、酵母浸 膏、玉米浆粉等，通常认为这些对于裂殖壶菌积累丰富的多不饱和脂肪酸，高糖如葡萄糖或 甘油是必不可少的，因此，当前利用裂殖壶菌生产DHA成本非常高。 我国是农业大国，甘蔗是常见的木质纤维素，甘蔗榨糖处理后的甘蔗渣利用效率 并不高。专利技术人认为，甘蔗渣中的纤维素和半纤维素的含量较高，其酸水解后可产生大量的 葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和少量氮源，可能会满足裂殖壶菌生长代谢对于碳源的要求。如果 能够利用可再生的甘蔗渣水解液作为培养基来培养裂殖壶菌，则裂殖壶菌发酵生产DHA的 成本会大大降低，同时也能够节约大量能源。但是，纤维素水解后除了产生细胞生长必需的 碳源和氮源之外，往往还存在木质素降解的副产物如甲酸、乙酸、5-羟甲基糠醛等对细胞有 毒性的物质，野生型的裂殖壶菌根本无法在纤维素水解液中生长。这一问题的常规解决思 路和方法是将纤维素水解液进行脱毒处理，使其满足裂殖壶菌的生长要求，但脱毒过程耗 时耗力，而且二次污染严重。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种采用裂殖壶菌发酵方法生产二十二碳六烯酸的方法， 该方法能够直接利用未脱毒的甘蔗渣水解液发酵生产裂殖壶菌，或者进一步生产二十二碳 六烯酸，该方法无需对甘蔗渣水解液进行脱毒处理，成本低廉。 本专利技术提供如下技术方案： -种，该方法采用能够直接在未脱毒的 甘蔗渣水解液中生长的裂殖壶菌菌株作为菌体进行发酵。 具体地，本专利技术的，包括如下步骤： (1)将能够直接在未脱毒的甘蔗渣水解液中生长的裂殖壶菌菌株培养，得到种子 液； (2)将所述种子液接种至利用所述未脱毒的甘蔗渣水解液制成的发酵培养液中， 发酵培养，得到二十二碳六烯酸； 其中，所述未脱毒的甘蔗渣水解液是甘蔗渣水解液原液或者甘蔗渣水解液原液的 稀释液；所述甘蔗渣水解液原液是将甘蔗渣进行酸热处理，再调节pH至5~7得到的；所述 发酵培养液添加有盐分。 根据本专利技术的方法，优选地，步骤（1)的裂殖壶菌菌株通过如下方法选育： 0-)制备裂殖壶菌初始菌体的菌悬液； (2'）将所述菌悬液涂布于甘蔗渣水解液固体培养基上培养； 所述甘蔗渣水解液固体培养基由甘蔗渣水解液，加入盐分和琼脂制成；所述甘蔗 渣水解液的浓度使菌体的死亡率高于90% ; 所述甘蔗渣水解液，是将甘蔗渣进行酸热处理，再调节pH至5~7得到的甘蔗渣 水解液原液或由所述甘蔗渣水解液原液稀释得到的稀释液； (3'）挑选所述甘蔗渣水解液固体培养基上成活的单菌落，分别传代培养； (4'）选择能够稳定传代且菌体DHA产量高的菌株。 步骤（Γ)中所述裂殖壶菌初始菌体可以为市售的任何裂殖壶菌菌体，优选为能 够高产DHA的裂殖壶菌菌体。根据本专利技术一种实施方式，所述裂殖壶菌初始菌体采用裂殖 壶菌（Schizochytriumsp.)，为科学研究领域流通使用的菌种，可以直接从市面上购买获 得，也可以从保存有该菌种的相关的科研单位（例如福建师范大学）索取。 根据本专利技术的方法，优选地，步骤（1)采用的裂殖壶菌菌株为通过上述选育方法 得到的裂殖壶菌菌株Schizochytriumsp.FNU1，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC)， 保藏号为CCTCCΜ2015636。更优选地，所述菌株是经过活化的。活化方法可采用本领域 的常规方法。 根据本专利技术的方法，步骤（1)中种子液可以采用本领域通常发酵培养方法制得， 所述发酵培养方法可以采用含有葡糖糖、蛋白胨、酵母浸膏和盐分的培养基，所述盐分按照 培养裂殖壶菌的常规配方添加即可。通常直接使用海水晶就能够满足盐分需要。海水晶是 海水及盐化工的产物，主要是通过对海水或齒水进行蒸发、离心、浓缩等一系列过程并加入 微量元素而生产出来的。采用市售的海水晶都可以满足需求。优选地，步骤（1)可通过一 级培养或多级培养，例如2~3级培养，得到种子液。通过多级培养更有利于菌株的增殖和 后期的发酵培养。根据本专利技术一种优选的实施方式，步骤（1)首先将所述裂殖壶菌接种于 种子培养液中，培养24~36h，得到一级种子液；再将所述一级种子液以5~25vt%，优选 为10~20vt%的接种量接种于种子培养液中，培养24~36h，得到二级种子液。优选地， 所述种子培养液的配方为：葡萄糖30~60g/L、蛋白胨10~20g/L、酵母浸膏5~15g/L，海 水晶20~30g/L。优选地，步骤（1)培养温度为25~30°C，振摇培养，振摇转速为180~ 220r/min〇 根据本专利技术的方法，优选地，步骤（2)中，所述未脱毒的甘蔗渣水解液原液是利用 甘蔗渣制得的，制备方法为：将甘蔗渣与pH值为0. 3~1. 5的酸液按照固液比为1:3~6 混合，于120~150°C下反应60~120min，过滤，调节pH至5~7,得到所述甘鹿渣水解液 原液。所述酸液的氢离子浓度为〇. 01~〇. 〇6mol/L。所述酸可以为能够满足上述pH值的 各种酸，例如可以选自硫酸、硝酸、盐酸和磷酸。实施时，可以将pH值换算成体积浓度，以方 便配备，以硫酸为例，浓度可以为〇· 005~0· 03mol/L，优选为0· 01~0· 02mol/L。采用碱 液调节pH，所述碱液可以是氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、氢氧化钙水溶液、氨水中的 一种或几种等。优选地，所述碱液采用氢氧化钙溶液。所述甘蔗渣为甘蔗榨糖后所得。优 选地，所述甘蔗渣经过干燥处理，含水量在5wt%以下。根据本专利技术一种优选的实施方式， 所述的干燥处理的温度为60~80°C，时间2~3天，可选地，同时增加鼓风操作，以增强干 燥效果。例如，可采用鼓风干燥箱进行干燥处理。根据本专利技术的选育方法，优选地，所述甘 蔗渣在干燥前或干燥后进行粉碎处理，优选在干燥后进行粉碎处理。根据本专利技术优选的实 施方式，所述甘蔗渣粉碎至粒径为2~20_时，更有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用裂殖壶菌生产二十二碳六烯酸的方法，包括如下步骤：(1)将能够直接在未脱毒的甘蔗渣水解液中生长的裂殖壶菌菌株培养，得到种子液；(2)将所述种子液接种至利用所述未脱毒的甘蔗渣水解液制成的发酵培养液中，发酵培养，得到二十二碳六烯酸；其中，所述未脱毒的甘蔗渣水解液是甘蔗渣水解液原液或者甘蔗渣水解液原液的稀释液；所述甘蔗渣水解液原液是将甘蔗渣进行酸热处理，再调节pH至5～7得到的；所述发酵培养液添加有盐分。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张明亮，祁峰，黄建忠，徐威，江贤章，孙磊，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：福建;35