一种微生物体内合成脂肪醇乙酸酯的方法技术

本发明专利技术公开了一种微生物内基于脂肪酸代谢途径三个中间产物为前体分子合成信息素脂肪醇乙酸酯的方法，其步骤为：首先通过微生物中高表达脂酰-ACP还原酶AAR、羧酸还原酶CAR、脂酰-CoA还原酶FAR及醛还原酶AHR，分别得到可还原脂酰-ACP、脂肪酸或脂酰-CoA产脂肪醇的工程菌。最后在产脂肪醇工程菌中高表达醇乙酰基转移酶ATF1,用于催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成信息素脂肪醇乙酸酯。本发明专利技术可实现由葡萄糖到脂肪醇乙酸酯的微生物转化，为大规模的生物合成脂肪醇乙酸酯提供了一个可行道路。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物基因工程领域，具体涉及改造微生物代谢途径，从单糖直接合成信息素脂肪醇乙酸酯的方法。
技术介绍
1、昆虫性信息素，又称性外激素(人工合成用于防治害虫的又称为性引诱剂)，是由同种昆虫某一性别个体的特殊器官分泌于体外，能被同种异性个体的感受器所接受，并使其产生相应行为反应或生理效应(如觅偶、定向求偶、交配等)的微量化学物质。至今，已鉴定出约2000种昆虫性信息素，大多数性信息素为各种脂肪醇乙酸酯分子。目前已有少数昆虫性信息素实现了化学全合成。由于应用昆虫性信息素进行害虫监测和防治具有高效、无毒、无污染、不伤害天敌昆虫等优点，国内外学者十分重视对昆虫性信息素的研究和应用。2、昆虫性信息素是昆虫本身的产物，因此其最大的优点就是使用非常安全，害虫不产生抗性、灵敏度高、用量少、专属性强、不污染环境、对天敌无害甚或有利，对生态环境的干扰小、不造成破坏。目前昆虫性信息素被用于虫情检测、大量诱捕、干扰交配、配合治虫、害虫检疫、区分近缘种等方面。但由于绝大多数的种类的昆虫性信息素还未能实现商品化生产，限制了其更广泛的应用。3、目前已商品化的性信息素均为通过化学法合成。化学法合成性信息素需涉及到多个反应步骤导致合成成本较高。通过生物技术手段，实现微生物发酵单糖合成各种性信息素，可有效的降低成本。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，在微生物内构建一条由单糖转化到脂肪醇乙酸酯的代谢途径。为实现上述目的，本专利技术提供了在大肠杆菌合成脂肪醇乙酸酯的方法，合成示意图如图1所示，主要步骤为: (1)构建基于脂酰-ACP为前体分子产脂肪醇乙酸酯工程菌将来自Symchococcusies菌的脂酰-ACP还原酶AAR基因、大肠杆菌的醛还原酶AHR基因和酿酒酵母醇乙酰基转移酶ATF1基因，重组到载体pET28a(+)上，得到载体pDY05o将该载体转入到大肠杆菌中，实现上述三个基因在大肠杆菌中的高量表达，得到大肠杆菌工程菌株⑶Y2。表达AAR用于催化脂酰-ACP还原为脂肪醛，表达AHR用于随后催化脂肪醛还原形成脂肪醇，表达ATF1用于最终催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯。脂酰-ACP和乙酸辅酶A均可由大肠杆菌发酵单糖合成，为此上述构建的GDY2工程菌可有效的将单糖转化为脂肪醇乙酸酯。(2)构建基于脂肪酸为前体分子产脂肪醇乙酸酯工程菌将来自Mycobacterium菌的羧酸还原酶CAR基因和酿酒酵母醇乙酰基转移酶ATF1基因，重组到载体pET28a(+)上，得到载体pDYlO。将来自大肠杆菌的醛还原酶AHR及硫酯酶‘TESA基因、枯草芽孢杆菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶Sfp基因，重组到载体PBBR1MCS1上，得到载体pDY09。将上述两个载体同时转入到大肠杆菌中，实现上述五个基因在大肠杆菌中的高量表达，得到大肠杆菌工程菌株⑶Y4。表达‘TESA用于水解脂酰-ACP产生脂肪酸，表达CAR用于催化脂肪酸还原为脂肪醛，表达Sfp用于活化CAR酶，表达AHR用于随后催化脂肪醛还原形成脂肪醇，表达ATF1用于最终催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯。脂肪酸和乙酸辅酶A均可由大肠杆菌发酵单糖合成，为此上述构建的GDY4工程菌可有效的将单糖转化为脂肪醇乙酸酯。(3)构建基于脂酰-ACP和脂酰-C0A为前体分子产脂肪醇乙酸酯工程菌将来自Marinobacter菌的脂酰_CoA还原酶FAR基因和酿酒酵母醇乙酰基转移酶ATF1基因，重组到载体pET28a(+)上，得到载体pDY12。将该载体转入到大肠杆菌中，实现上述两个基因在大肠杆菌中的高量表达，得到大肠杆菌工程菌株⑶Y6。表达FAR用于催化脂酰-ACP和脂酰-C0A还原为脂肪醇，表达ATF1用于最终催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯。脂酰-ACP、脂酰-C0A和乙酸辅酶A均可由大肠杆菌发酵单糖合成，为此上述构建的GDY6工程菌可有效的将单糖转化为脂肪醇乙酸酯。本专利技术的优点是在大肠杆菌引入外源基因构建一条合成脂肪醇乙酸酯的代谢途径，最终实现以单糖为原料合成脂肪醇乙酸酯的目的，不需要通过过多的化学合成反应，减少化学合成过程中有毒物质的释放，也减少了合成成本。同时，由于大肠杆菌生长速度快，遗传操作技术成熟，且发酵过程不会对环境造成污染破坏。【附图说明】图1.生物合成脂肪醇乙酸酯路径图。ATF1:醇乙酰基转移酶(alcoholacetyl transferase)来自 S.cerevisiae 菌；AAR:脂酰-ACP 还原酶(fatty acyl- ACPreductase)来自 S.elongates 菌;CAR:竣酸还原酶(carboxylic acid reductase)来自M.marinum菌；FAR:脂酰-CoA还原酶(fatty acyl- CoA reductase)来自 M.aquaeolei菌；AHR:酸还原酶(aldehyde reductase)来自 E.coli 菌;FadD:脂酰-CoA合酶(fattyacyl-CoA synthetase)来自 E.coli ; ’ TesA:去除信号肽的硫酯酶(a truncated fattyacyl-ACP th1esterase)来自 E.coli 菌.图2.基于脂酰-ACP为前体分子合成脂肪醇或脂肪醇乙酸酯的大肠杆菌工程菌⑶Y1和⑶Y2发酵产物GC-MS检测结果。1号峰代表内标碳十五脂肪酸甲酯(MethylPentadecanoate), 2号峰代表碳十五脂肪醇内标(Pentadecanol)，3号峰代表碳十六脂肪醇乙酸酯(Hexadecanol acetate ester)，4号峰代表碳十六脂肪醇(Hexadecanol )，5号峰代表Δ 9-碳十八稀脂肪醇乙酸酯(9-0ctadecen-l-ol acetate ester)，6号峰代表Δ9_碳十八稀脂肪醇(9-Octadecen-l-ol alcohol)。图3.基于脂肪酸为前体分子合成脂肪醇或脂肪醇乙酸酯的大肠杆菌工程菌⑶Y3和⑶Y4发酵产物GC-MS检测结果。1号峰为碳十二脂肪醇乙酸酯(Dodecanolacetate ester)，2号峰为碳十二脂肪醇(Dodecanol )，3号峰为Δ 9_碳十二稀醇(9-Dodecanol-l-ol)，4 号峰为碳十四脂肪醇乙酸酯(Tetradecanol acetate ester),5号峰为碳十五脂肪酸甲酯内标(Methyl Pentadecanoate)，6号峰为碳十四脂肪醇(Tetradecanol)，7号峰为△ 9_碳十四稀醇(9-Tetradecen-l-ol)，8号峰为碳十五醇内标(Pentadecanol)，9 号峰为 Δ9-碳十六稀醇乙酸酯(9-Hexadecen-l-ol acetateester), 10号峰为碳十六脂肪醇(Hexadecanol)，11号峰为Δ 9_碳十六稀脂肪醇(9-Hexadecen-l-ol), 12 号峰为 Δ 9_ 碳十八稀醇乙酸酯(9-Octadecen-l-ol acetateester), 13 号峰为 Δ 9_ 碳十八稀醇(9-Octadecen-l-ol)。图4.基于脂酰-ACP和脂酰-CoA为前体分子合成脂肪醇或脂肪醇乙酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在微生物合成脂肪醇乙酸酯的方法，其特征在于基于脂酰‑ACP为前体分子产脂肪醇乙酸酯：将脂酰‑ACP还原酶AAR基因、醛还原酶AHR基因和醇乙酰基转移酶ATF1基因，重组到载体；将该载体转入到微生物中，实现上述三个基因在微生物的高量表达，得到工程菌株；表达AAR用于催化脂酰‑ACP还原为脂肪醛，表达AHR用于随后催化脂肪醛还原形成脂肪醇，表达ATF1用于最终催化脂肪醇与乙酰辅酶A反应合成脂肪醇乙酸酯；脂酰‑ACP和乙酸辅酶A均可由微生物发酵单糖合成，为此上述构建的工程菌可有效的将单糖转化为脂肪醇乙酸酯。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郭道义，潘虹，李勋，李永东，范小林，
申请(专利权)人：赣南师范学院，
类型：发明
国别省市：江西;36