用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其用于，包括磁性氧化石墨烯合成以及依次将偶联试剂、肿瘤标志物一抗固载到磁性氧化石墨表面得到功能化氧化石墨烯制备的步骤：功能化氮化碳的制备以及依次将纳米金颗粒、肿瘤标志物二抗固载氮化碳薄膜表面得到功能化氮化碳的步骤；最后将功能化氧化石墨烯、待测肿瘤标志物和功能化氮化碳依次吸附于磁性玻碳电极表面即可，将得到夹心式电化学发光免疫传感器作为工作电极；采用铂电极作为对电极，Ag/AgCl电极或者饱和甘汞电极作为参比电极，即可计算得到待测样品溶液中肿瘤标志物的准确浓度，优点是检测速度快、检测结果灵敏度和准确性高、特异性强。

【技术实现步骤摘要】
用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用
本专利技术涉及电化学发光免疫传感器，尤其是涉及用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。
技术介绍
肿瘤是人类健康的杀手。恶性肿瘤也称为癌症，是当前严重威胁人类健康和生命的一类疾病，它是机体受各种内在或外在致癌因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失掉了对其自身生长的正常调控，导致不正常增生而形成的新生物。据WHO研究，2012年全球癌症患者和死亡病例都在令人不安地增加，新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居世界第一位。WHO也指出，及早诊断和治疗是对抗肿瘤疾病的有效手段之一，肿瘤的早期诊断是决定其预后的一个重要因素。肿瘤标志物是指在肿瘤的发生和增殖过程中产生的、反映肿瘤存在和生长的一类物质，包括蛋白质、激素、酶、基因等，是肿瘤早期诊断的重要指标。一般而言，肿瘤细胞越多，恶性程度越高，越晚期，肿瘤标志物的浓度越高。随着肿瘤早期诊断进入蛋白质时代，越来越多的高特异性、低丰度肿瘤标志物被发现，这就对建立快速、高灵敏度、高特异性肿瘤标志物检测技术提出了更高的要求。免疫分析法是利用抗体与抗原之间的特异性识别与结合而建立的高选择性生物化学方法。目前，检测肿瘤标志物的免疫分析方法主要有：放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附分析法(ELISA)、化学发光免疫分析法(CLIA)、电化学免疫分析法(ECIA)、电化学发光免疫分析法(ECLIA)和免疫电镜法等，这些方法都有一定的灵敏度和准确度，但也各有一定的不足之处：有的仪器昂贵、操作复杂、技术要求高，有的步骤繁多、易出现假阳性和假阴性，有的使用放射性试剂，有的特异性不强、灵敏度不高、选择性差，有的响应时间长、无法重复测量。因此，开发灵敏、准确、快速、简便的肿瘤标志物检测方法仍是迫切需求。电化学发光免疫传感器是电化学发光和免疫传感器相结合的产物，由于其灵敏度高、特异性好、重现性好、操作简便等优点，具有广阔的应用前景，并被广泛应用于临床分析和环境检测领域。氧化石墨烯是石墨烯的氧化物，是一种性能优异的新型碳材料，具有较高的比表面积和丰富的官能团，而基于氧化石墨烯制备的功能化氧化石墨烯稳定性高、制备简单，是构建电化学发光传感器的理想材料。氮化碳材料(g-C3N4)是一种类似石墨的纳米薄膜，具有比表面积大、稳定性强、硬度大、导电性好、生物相容性良好等特点，并且氮化碳材料本身具有极强的电化学发光的能力，非常适合用于开发电化学发光免疫传感器。目前国内外还没有公开任何关于基于氧化石墨烯和氮化碳两种纳米复合材料的用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种检测速度快、检测结果灵敏度和准确性高、特异性强的用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法及其应用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：(1)功能化氧化石墨烯(Ab1-nanoFe3O4@GO)的制备a.磁性氧化石墨烯的合成：在洁净的三颈烧瓶中加入30～50mL1mg/mL的氧化石墨烯，超声1h；然后在氮气氛保护下逐滴加入20～30mL0.05～0.07mol/L的氯化亚铁溶液和20～30mL0.10～0.15mol/L的氯化高铁溶液，于70～90℃搅拌回流，同时缓慢滴加10～15mL20～30wt％的氨水至溶液的pH＝10～11，搅拌回流处理3～5h；冷却后，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至溶液的pH＝7，定容到50mL，即得纳米四氧化三铁颗粒(nanoFe3O4)均匀覆盖在氧化石墨烯(GO)表面的磁性氧化石墨烯(nanoFe3O4@GO)溶液，4℃储存备用；b.取步骤(a)中所得的磁性氧化石墨烯(nanoFe3O4@GO)溶液200μL置于玻璃瓶中，超声1h，然后加入200～400μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸至溶液pH＝4～6，振荡孵育1h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤以去除偶联试剂，定容至200～300μL；用0.1～0.2mol/LNaOH溶液调pH为8.0～10.0，再加入30～50μL10-4～10-6mg/mL肿瘤标志物一抗(Ab1)孵育3～5h后，再加入50～100μL2wt％牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至中性后，定容至100～200μL，即得到功能化氧化石墨烯(Ab1-nanoFe3O4@GO)溶液；(2)功能化氮化碳(Ab2-Au@g-C3N4)的制备a.氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在500～600℃下加热3～5h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8～1.5g氮化碳粉末加入到80～120mL4～6mol/L硝酸溶液中，于120～150℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，12000rpm离心后弃去上清液，加入二次水洗涤；重复离心去上清洗涤步骤，直至上清液为中性；取沉淀加入50～100mL水，超声4个小时，8000rpm离心半个小时，保留上清液，即得到氮化碳薄膜溶液；b.取30～70mL氮化碳薄膜溶液加入到30～70mL直径10～30nm的胶体金溶液中，室温下搅拌16～24h，6000～8000rpm离心半个小时后，取上部溶液即得到表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液；取200μL表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液于玻璃瓶中，加入30～50μL10-4～10-6mg/mL肿瘤标志物二抗(Ab2)后孵育3～5h，通过抗体表面的氨基与纳米金的结合作用，将肿瘤标志物二抗Ab2固载到氮化碳薄膜表面；然后加入50～100μL2wt％牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h；12000rpm离心，去除上清液后加入水清洗；重复离心去上清洗涤3次后，取沉淀加入水定容至200～300μL，即得功能化氮化碳(Ab2-Au@g-C3N4)溶液；(3)电化学发光免疫传感器的组装a.将直径为3～5mm的磁性玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，然后依次用体积比为50％的乙醇水溶液、体积比为50％的硝酸水溶液和蒸馏水超声清洗2min；b.取5～10μL步骤(1)得到的功能化氧化石墨烯(Ab1-nanoFe3O4@GO)溶液，滴在上述预处理过的磁性玻碳电极表面，功能化氧化石墨烯即被均匀、牢固地吸附于电极表面；将吸附有功能化氧化石墨烯的磁性玻碳电极浸入在待测肿瘤标志物溶液中，置于35℃孵育1～2h后，清洗；再置于5～10μL步骤(2)得到的功能化氮化碳溶液中，于35℃中孵育1～2h后，清洗，即得到用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器。步骤(1)b中所述的偶联试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于水中得到，所述的偶联试剂中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)的摩尔浓度为10～100mmol/L，所述的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的摩尔浓度为1～10mmol/L。步骤(2)b中所述的胶体金溶液制备方法如下：将1～3mL1wt％氯金酸溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)功能化氧化石墨烯的制备a.磁性氧化石墨烯的合成：在洁净的三颈烧瓶中加入30～50mL 1mg/mL的氧化石墨烯，超声1h；然后在氮气氛保护下逐滴加入20～30mL 0.05～0.07mol/L的氯化亚铁溶液和20～30mL 0.10～0.15mol/L的氯化高铁溶液，于70～90℃搅拌回流，同时缓慢滴加10～15mL 20～30wt％的氨水至溶液的pH＝10～11，搅拌回流处理3～5h；冷却后，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至溶液的pH＝7，定容到50mL，即得磁性氧化石墨烯溶液，4℃储存备用；b.取步骤(a)中所得的磁性氧化石墨烯溶液200μL置于玻璃瓶中，超声1h，然后加入200～400μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸至溶液pH＝4～6，振荡孵育1h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤以去除偶联试剂，定容至200～300μL；用0.1～0.2mol/L NaOH溶液调pH为8.0～10.0，再加入30～50μL 10‑4～10‑6mg/mL肿瘤标志物一抗，孵育3～5h后，再加入50～100μL 2wt％牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至中性后，定容至100～200μL，即得到功能化氧化石墨烯溶液；(2)功能化氮化碳的制备a.氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在500～600℃下加热3～5h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8～1.5g氮化碳粉末加入到80～120mL 4～6mol/L硝酸溶液中，于120～150℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，12000rpm离心后弃去上清液，加入二次水洗涤；重复离心去上清洗涤步骤，直至上清液为中性；取沉淀加入50～100mL水，超声4个小时，8000rpm离心半个小时，保留上清液，即得到氮化碳薄膜溶液；b.取30～70mL氮化碳薄膜溶液加入到30～70mL直径10～30nm的胶体金溶液中，室温下搅拌16～24h，6000～8000rpm离心半个小时后，取上部溶液即得到表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液；取200μL表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液于玻璃瓶中，加入30～50μL10‑4～10‑6mg/mL肿瘤标志物二抗后孵育3～5h；然后加入50～100μL 2wt％牛血清白蛋白溶液，继续孵育1～2h；12000rpm离心，去除上清液后加入水清洗；重复离心去上清洗涤3次后，取沉淀加入水定容至200～300μL，即得功能化氮化碳溶液；(3)电化学发光免疫传感器的组装a.将直径为3～5mm的磁性玻碳电极依次用1.0、0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉在麂皮上抛光至镜面，然后依次用体积比为50％的乙醇水溶液、体积比为50％的硝酸水溶液和蒸馏水超声清洗2min；b.取5～10μL步骤(1)得到的功能化氧化石墨烯溶液，滴在上述预处理过的磁性玻碳电极表面，功能化氧化石墨烯即被均匀、牢固地吸附于电极表面；将吸附有功能化氧化石墨烯的磁性玻碳电极浸入在待测肿瘤标志物溶液中，于35℃孵育1～2h后清洗；再置于5～10μL步骤(2)得到的功能化氮化碳溶液中，于35℃中孵育1～2h后清洗，即得到用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测肿瘤标志物的夹心式电化学发光免疫传感器的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)功能化氧化石墨烯的制备a.磁性氧化石墨烯的合成：在洁净的三颈烧瓶中加入30～50mL1mg/mL的氧化石墨烯，超声1h；然后在氮气氛保护下逐滴加入20～30mL0.05～0.07mol/L的氯化亚铁溶液和20～30mL0.10～0.15mol/L的氯化高铁溶液，于70～90℃搅拌回流，同时缓慢滴加10～15mL20～30wt％的氨水至溶液的pH＝10～11，搅拌回流处理3～5h；冷却后，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至溶液的pH＝7，定容到50mL，即得磁性氧化石墨烯溶液，4℃储存备用；b.取步骤a中所得的磁性氧化石墨烯溶液200μL置于玻璃瓶中，超声1h，然后加入200～400μL偶联试剂，混合均匀，同时滴加稀盐酸至溶液pH＝4～6，振荡孵育1h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤以去除偶联试剂，定容至200～300μL；用0.1～0.2mol/LNaOH溶液调pH为8.0～10.0，再加入30～50μL10-4～10-6mg/mL肿瘤标志物一抗，孵育3～5h后，再加入50～100μL2wt％牛血清白蛋白溶液以封闭非特异性吸附位点，继续孵育1～2h，外加磁铁磁性分离后用二次水洗涤至中性后，定容至100～200μL，即得到功能化氧化石墨烯溶液；(2)功能化氮化碳的制备a.氮化碳薄膜的合成：将三聚氰胺在500～600℃下加热3～5h，真空干燥后，得到氮化碳粉末；取0.8～1.5g氮化碳粉末加入到80～120mL4～6mol/L硝酸溶液中，于120～150℃下回流24～48小时后，自然冷却至室温，12000rpm离心后弃去上清液，加入二次水洗涤；重复离心去上清洗涤步骤，直至上清液为中性；取沉淀加入50～100mL水，超声4个小时，8000rpm离心半个小时，保留上清液，即得到氮化碳薄膜溶液；b.取30～70mL氮化碳薄膜溶液加入到30～70mL直径10～30nm的胶体金溶液中，室温下搅拌16～24h，6000～8000rpm离心半个小时后，取上部溶液即得到表面均匀结合有纳米金颗粒的氮化碳薄膜溶液；取200μL表面均匀结合有纳米...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭智勇，武琳，张宁，沙玉红，卢静，贾亚茹，宋信信，李温柔，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33