本申请描述了用于改善无细胞合成系统中正确折叠的生物学活性目标蛋白的表达的方法和系统。所述方法和系统使用具有活性氧化磷酸化系统的细菌无细胞提取物，并且包含外源蛋白伴侣。可通过用来制备所述无细胞提取物的细菌表达所述外源蛋白伴侣。所述外源蛋白伴侣可为蛋白二硫键异构酶和/或肽基脯氨酰顺反异构酶。发明专利技术人发现，蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰顺反异构酶的组合对正确折叠的生物学活性目标蛋白的量产生协同增加。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】使用呈现出蛋白伴侣表达水平升高的经转化的细菌细胞在 细菌无细胞合成系统中表达生物学活性蛋白 相关申请的交叉引用 本申请要求于2013年4月19日提交的美国专利申请第61/813,914号和于2014 年2月7日提交的美国专利申请第61/937,069号的优选权的益处，其各自的公开通过引用 整体并入本文。 涉及"序列表"、表或计算机程序的列表附录提交为ASCII文本文件 为了所有目的，将于2014年4月16日创建的文件-58-2PC.TXT中书写的序列表 (73, 728字节，机读格式IBM-PC，MS-Windows操作系统）通过引用整体并入本文。 专利技术背景 在细菌无细胞合成系统中表达蛋白是一种用于表达重组靶蛋白的成熟建立的技 术。可从表达或过表达目标蛋白的细菌制备提取物以提供细菌无细胞合成系统，所述细菌 无细胞合成系统具有取决于所述蛋白的改变的特性。然而，细菌生长期间蛋白的过表达经 常导致细菌较慢的生长速率和从所述细菌制备的提取物中较低的蛋白合成活性。 进一步，来自这样的提取物的重组蛋白的表达通常导致不正确的折叠和生物学活 性的损失。蛋白伴侣的使用可改善蛋白的正确折叠和其生物学活性。因此，存在对改善的 用于表达重组蛋白的细菌细胞提取物的需求，所述细菌细胞提取物从过表达蛋白伴侣的细 菌制备，其中这样的提取物可合成大量正确折叠的蛋白。如下所述，本专利技术满足以上这些需 求和其他需求。 专利技术概述 本公开提供用于改善无细胞合成系统中生物学活性和/或正确折叠的目标蛋白 的表达的方法和系统。所述无细胞合成系统包含细菌提取物，所述细菌提取物具有活性氧 化磷酸化系统和用于无细胞蛋白合成所需的组分。所述无细胞合成系统还包含外源蛋白伴 侣。在某些实施方案中，通过用来制备所述细菌提取物的细菌表达外源蛋白伴侣。 因此，在一个方面，描述了改善细菌无细胞合成系统中生物学活性蛋白的表达水 平的方法，所述方法包括以下步骤： i)制备细菌提取物，所述细菌提取物具有活性氧化磷酸化系统且包含用于无细胞 蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，其中用来制备所述提取物的细菌以至 少约lgm/升的提取物浓度表达外源蛋白伴侣； ii)合并所述细菌提取物与编码目标蛋白的核酸，以产生细菌无细胞合成系统； 以及iii)在允许目标蛋白的表达至浓度至少约100mg/L的条件下，孵育所述细菌无细 胞合成系统。 在第二方面，描述了用于表达生物学活性蛋白的细菌无细胞合成系统，所述系统 包含：i)细菌的无细胞提取物，所述细菌的无细胞提取物具有活性氧化磷酸化系统且含 有用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，并且其中在细菌中以至 少lgm/升的提取物水平表达外源蛋白伴侣；和， ii)编码目标蛋白的核酸， 其中所述细菌无细胞合成系统表达目标蛋白至浓度至少约100mg/L。 在第三方面，描述了在细菌无细胞合成系统中表达正确折叠的生物学活性蛋白的 方法，所述方法包括以下步骤： i)制备细菌提取物，所述细菌提取物包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能 tRNA、氨基酸、核糖体，蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶，其中蛋白二硫键 异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶以足以改善正确折叠的生物学活性蛋白的表达的浓 度存在； ii)合并所述细菌提取物与编码目标蛋白的核酸；以及 iii)在允许目标蛋白的表达和正确折叠的条件下，孵育所述细菌提取物与所述核 酸。 在第四方面，描述了用于表达生物学活性蛋白的细菌无细胞合成系统，所述系统 包含： i)细菌的无细胞提取物，所述细菌的无细胞提取物具有活性氧化磷酸化系统且含 有用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，并且还包含蛋白二硫键 异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶， 其中，所述蛋白二硫键异构酶和肽基脯氨酰基顺/反异构酶以足以改善正确折叠 的生物学活性蛋白的表达的浓度存在；和 ii)编码目标蛋白的核酸， 其中，所述细菌无细胞合成系统表达目标蛋白至浓度至少约100mg/L。 在第五方面，描述了改善大肠杆菌（Ecoli)细胞培养物的活力和/或生长速率的 方法，所述方法包括以下步骤： i)用表达蛋白DsbC的核酸转化大肠杆菌，所述表达蛋白DsbC的核酸可操作地连 接组成型启动子；以及 ii)在允许过表达DsbC蛋白至胞内浓度至少lmg/ml的条件下，培养被转化的大肠 杆菌细胞。 附图简述 图1显示真核PDI和细菌DsbC为功能上可互换的。 图2A显示实施例中所描述的蛋白伴侣顺序表达筛选的示意图。 图2B显示通过将细菌无细胞系统表达的蛋白伴侣加入至细菌无细胞合成系统可 改善IgG滴度。 图3显示蛋白伴侣Skp、SlyD和FkpA改善正确组装的IgG的溶解性和/或量。 图4显示蛋白伴侣FkpA改善IgG蛋白的溶解性和折叠。 图5显示将纯化的FkpA加入至含有DsbC的提取物促进IgG的折叠。 图6显示将外源的DsbC蛋白加入至含有FkpA的提取物增加IgG滴度。 图7显示在提取物中通过CFPS所产生的GMCSF蛋白的量，所述提取物来自表达蛋 白伴侣DsbC或FkpA的所示的菌株。 图8显示转化有质粒的细菌菌株的生长速率，所述转化有质粒的菌株在组成型启 动子的控制下表达IX或2X拷贝的DsbC(上图）。下图显示存在于周质裂解物中的DsbC蛋 白的量。 图9显示通过过表达IX或2X拷贝DsbC的细菌菌株所产生的DsbC蛋白的量。上 图显示细胞内浓度。下图显示提取物浓度。图10显示转化有质粒的细菌菌株的生长速率（上图），所述转化有质粒的菌株在 组成型启动子的控制下表达IX或2X拷贝FkpA。下面左图显示存在于总提取物中的FkpA 蛋白的量，所述提取物制备自表达IX和2X拷贝FkpA的细菌。下面右图显示细菌菌株的倍 增时间。 图11显示来自表达IX和2X拷贝FkpA的细菌的提取物中FkpA浓度的测定量。 图12显示将C端His标签加至FkpA的结果。（a)显示通过在30 °C下提取物 活化（预孵育）后的离心旋转，增加了提取物的FkpA水平，所述提取物制备自过表达 FkpA-His(2XFkpA-His(e49))的细菌。（b)显示含有FkpA-His的提取物比含有野生型FkpA 的提取物产生更多的总IgG(比较2XFkpA(e44)与2XFkpA-His(e49))，并且通过将活化后的 提取物离心增加了正确折叠的IgG(比较最终旋转的2XFkpA与最终旋转的2XFkpA-His)。 对照（Con) 1和对照2为对照提取物，其制备自不表达FkpA的细菌。 图13显示蛋白伴侣的过表达改善了开放式无细胞合成系统中几种IgG的产 量。㈧在SBJY001、2xDsbC和2xD+2xF提取物中，在14C-亮氨酸存在下表达曲妥珠单 抗（trastuzumab)、结合CD30抗原的布妥昔单抗（brentuximab)以及与生殖细胞系轻链 Vk3-20结合的生殖细胞系重链VH3-7和VH3-23,并且通过SDS-PAGE和放射自显影显现。 (B)如实施例所述定量不同的提取物中所表达的组装的IgG。 定义 除非另有定义，本文使用的技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的含 义相同。参见例如，Lack本文档来自技高网...
【技术保护点】
改善细菌无细胞合成系统中生物学活性蛋白的表达水平的方法，其包括以下步骤：i)制备细菌提取物，所述细菌提取物具有活性氧化磷酸化系统且包含用于无细胞蛋白合成所需的生物学功能tRNA、氨基酸和核糖体，其中用来制备所述提取物的细菌以至少约1gm/升的提取物浓度表达外源蛋白伴侣；ii)合并所述细菌提取物与编码目标蛋白的核酸，以产生细菌无细胞合成系统；以及，iii)在允许所述目标蛋白表达至浓度至少约100mg/L的条件下，孵育所述细菌无细胞合成系统。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：艾丽丝·扬，丹·格罗夫，帕特里克·里弗斯，克里斯托弗·D·萨诺斯，
申请(专利权)人：苏特罗生物制药公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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