使用无细胞蛋白质合成系统大规模生产抗体的方法技术方案

本文所描述的是使用无细胞蛋白质合成系统来大规模生产抗体的方法。所述方法包括在轻链(LC)多肽存在的情况下，在无细胞细菌提取物中从编码重链的核酸表达抗体的重链(HC)多肽，从而产生抗体。所述方法以适于抗体商业化生产的大规模进行，例如在等于或大于约10升，例如约10至约25,000升的反应体积中进行。相对于在与重链多肽相同的无细胞蛋白质合成系统中合成轻链，所述方法使得每单位体积的正确折叠和组装的抗体的产量增加。组装的抗体的产量增加。组装的抗体的产量增加。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用无细胞蛋白质合成系统大规模生产抗体的方法
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求2020年9月14日递交的第63/078,254号美国临时申请的优先权的权益，其公开内容在此通过引用整体并入本文中，以用于所有目的。序列表
[0002]本申请含有序列表，所述序列表以ASCII格式通过电子提交，并且在此通过引用将其全部内容并入本文中。所述ASCII副本创建于2021年9月8日，名为091200
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006910PC_SL.txt，并且大小为65,782字节。背景
[0003]本公开提供了以适于商业化生产的大规模来产生目标蛋白质的方法及系统。所述方法可以增加总产量和/或正确折叠和组装的目标蛋白质(诸如，抗体)的产量。专利技术概述
[0004]本文所述的是用于增加无细胞蛋白质合成系统中正确折叠的抗体的产量的方法和组成物。在一方面，所述方法以适于商业化生产相对大量的正确折叠的抗体的规模进行。因此，本文所述的是使用无细胞蛋白质合成系统来大规模生产抗体的方法，所述方法包括在轻链(LC)多肽存在的情况下，从编码重链的核酸表达抗体的重链(HC)多肽，从而产生所述抗体。在一些实施方案中，所述无细胞蛋白质合成系统包含具有约10至约25,000升体积的反应混合物。在一些实施方案中，所述HC的表达在具有约10至约10,000升体积的反应混合物中进行。在一些实施方案中，所述HC的表达在具有约15,000至约25,000升体积的反应混合物中进行。在一些实施方案中，所述反应混合物包含等于或大于约10升至约25,000升的体积。在一些实施方案中，所述反应混合物包含等于或小于约10升至约25,000升的体积。在一些实施方案中，所述反应混合物包含10,000升至约20,000升的体积。
[0005]在一些实施方案中，所述反应混合物包含细菌提取物，且所述HC的表达包括：(i)合并所述细菌提取物与编码所述HC的核酸；和(ii)在允许所述HC表达的条件下孵育所述无细胞蛋白质合成系统。
[0006]在一些实施方案中，与在同一反应混合物中表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的总抗体蛋白质的产量增加。在一些实施方案中，与在同一反应混合物中表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的正确折叠的抗体蛋白质的产量增加。在一些实施方案中，与在同一反应混合物中表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的总抗体蛋白质的产量和正确折叠的抗体蛋白质的产量增加。在一些实施方案中，与在同一反应混合物中同时表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的总抗体蛋白质的产量和/或每升的正确折叠的抗体蛋白质的产量增加。
[0007]在一些实施方案中，与表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的正确折叠的抗体蛋白质的产量高约30％至约90％或更大。在一些实施方案中，与表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的正确折叠的抗体蛋白质的产量高约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、或约90％或更大。在一些实施方
案中，所述重链多肽和所述轻链多肽之间的二聚化增加。在一些实施方案中，重链多肽和轻链多肽二聚体与重链多肽单体和轻链多肽单体的比值增加。
[0008]在一些实施方案中，在所述表达步骤之前将所述轻链多肽添加至所述反应混合物中。
[0009]在一些实施方案中，在被添加至所述反应混合物之前，在单独的反应中产生所述轻链多肽。在一些实施方案中，在被添加至所述反应混合物之前，合成或预制所述轻链多肽。在一些实施方案中，所述轻链多肽由在无细胞蛋白质合成系统、反应混合物或无细胞提取物中的编码所述轻链多肽的核酸表达。在一些实施方案中，所述轻链多肽由在完整活细胞中的编码所述LC多肽的核酸表达。在一些实施方案中，所述完整活细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述轻链多肽在添加至所述反应混合物之前，从无细胞蛋白质合成系统、反应混合物、无细胞提取物、或从细胞的培养物中纯化或部分地纯化。
[0010]在一些实施方案中，所述抗体为IgG、IgA或IgD亚型、或它们的组合。在一些实施方案中，所述抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗体选自：抗B细胞成熟抗原(抗BCMA)抗体、抗分化簇74(抗CD74)抗体、或抗叶酸受体α(FOLR1)抗体。在一些实施方案中，所述抗体包含FAB片段。
[0011]在一些方面，所述抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含异二聚体Fc区，其包含两个不对称的CH3结构域，所述CH3结构域包括来自IgA CH3结构域和IgG CH3结构域的序列。在一些实施方案中，所述双特异性抗体是结构域交换抗体，其中所述HC与所述LC二聚化。在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含经工程化的CH3结构域，其基于立体或静电互补性具有增强的HC异二聚化。在一些实施方案中，所述经工程化的CH3结构域包含杵(knob)和臼(hole)突变，其促进稳定CH3异二聚体的形成。在一些实施方案中，所述双特异性抗体包含一个Fab结构域和一个scFv结构域，其中所述Fab结构域和所述scFv结构域与不同抗原结合。
[0012]在一些方面，所述HC和/或所述LC包含至少一个非天然氨基酸(nnAA)。在一些实施方案中，所述HC包含至少一个非天然氨基酸(nnAA)。在一些实施方案中，所述HC中的nnAA可以与所述LC中的nnAA相同或不同。在一些实施方案中，所述nnAA是对乙酰基苯丙氨酸或对叠氮甲基
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苯丙氨酸。
[0013]在一些实施方案中，所述方法还包括在非还原条件下组装所述HC和所述LC以产生所述抗体。
[0014]在一些实施方案中，所述无细胞蛋白质合成系统包含具有相关辅因子的细菌提取物。在一些实施方案中，所述无细胞蛋白质合成系统包含从大肠杆菌(E.coli)菌株制备的细菌提取物。在一些实施方案中，所述无细胞蛋白质合成系统包括产生ATP的氧化磷酸化反应。在一些实施方案中，所述无细胞蛋白质合成系统包含重组核糖体系统。
[0015]在一些实施方案中，所述无细胞蛋白质合成系统包含外源性蛋白质分子伴侣。在一些实施方案中，所述外源性蛋白质分子伴侣选自：蛋白二硫异构酶(PDI)、肽基脯氨酰顺反异构酶(PPI)或解聚酶。在一些实施方案中，所述PDI选自：DsbA、Dsb或DsbG；所述PPI选自：FkpA、SlyD、tig、SurA、或Cpr6；和所述解聚酶选自IbpA、IbpB或Skp。
[0016]在一些实施方案中，所述无细胞蛋白质合成系统包含突变释放因子1蛋白质(RF1)。
[0017]还提供了无细胞蛋白质合成系统。在一方面，所述无细胞蛋白质合成系统包含：(i)包含细菌细胞提取物的反应混合物；(ii)编码重链多肽的核酸；和(iii)轻链多肽。在一些实施方案中，所述无细胞蛋白质合成系统包含具有约10至约25,000升体积的反应混合物。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.使用无细胞蛋白质合成系统来大规模生产抗体的方法，其包括在轻链(LC)多肽存在的情况下，从编码重链的核酸表达抗体的重链(HC)多肽，从而产生所述抗体，其中所述表达在具有约10至约25,000升体积的反应混合物中进行。2.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含约10至约10,000升的体积。3.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含约15,000升至约25,000升的体积。4.如权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含约10,000升至约20,000升的体积。5.如权利要求1
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4所述的方法，其中所述反应混合物包含细菌提取物，并且所述表达包括：(i)合并所述细菌提取物与编码所述HC的核酸；和(ii)在允许所述HC表达的条件下孵育所述无细胞蛋白质合成系统。6.如权利要求1
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5所述的方法，其中与在同一反应混合物中表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的总抗体蛋白质和正确折叠的抗体的产量增加。7.如权利要求1
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6所述的方法，其中与在同一反应混合物中表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的正确折叠的抗体的产量高约30％或更大。8.如权利要求1
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6所述的方法，其中与在同一反应混合物中表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的正确折叠的抗体的产量高约40％或更大。9.如权利要求1
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6所述的方法，其中与在同一反应混合物中表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的正确折叠的抗体的产量高约50％或更大。10.如权利要求1
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6所述的方法，其中与在同一反应混合物中表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的正确折叠的抗体的产量高约70％或更大。11.如权利要求1
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6所述的方法，其中与在同一反应混合物中表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，每升的正确折叠的抗体的产量高约80％或更大。12.如权利要求1
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11所述的方法，其中与在同一反应混合物中表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，所述重链多肽和所述轻链多肽之间的二聚化增加。13.如权利要求1
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12所述的方法，其中与在同一反应混合物中表达所述重链多肽和所述轻链多肽两者的反应混合物相比，重链多肽和轻链多肽二聚体与重链多肽单体和轻链多肽单体的比值增加。14.如权利要求1
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13所述的方法，其中在所述表达步骤之前将所述轻链多肽添加至所述反应混合物中。15.如权利要求14所述的方法，其中在被添加至所述反应混合物之前，在单独的反应中产生所述轻链多肽、合成或预制所述轻链多肽。16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述轻链多肽由在无细胞蛋白质合成系统、反应混合物或无细胞提取物中的编码所述轻链多肽的核酸表达。17.如权利要求14或15所述的方法，其中所述轻链多肽由在完整活细胞中的编码所述LC多肽的核酸表达。18.如权利要求17所述的方法，其中所述完整活细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞。19.如权利要求14
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18所述的方法，其中所述轻链多肽在添加至所述反应混合物之前，
从无细胞蛋白质合成系统、反应混合物、无细胞提取物、或从细胞的培养物中纯化或部分地纯化。20.如权利要求1
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19所述的方法，其中所述抗体为IgG、IgA或IgD亚型、或它们的组合。21.如权利要求1
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20所述的方法，其中所述抗体是单克隆抗体。22.如权利要求1
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21所述的方法，其中所述抗体选自：抗B细胞成熟抗原(抗BCMA)抗体、抗分化簇74(抗CD74)抗体、或抗叶酸受体α(FOLR1)抗体。23.如权利要求1
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19所述的方法，其中所述抗体包含FAB片段。24.如权利要求1
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19所述的方法，其中所述抗体是双特异性抗体。25.如权利要求24所述的方法，其中所述双特异性抗体包含异二聚体Fc区，其包含两个不对称的CH3结构域，所述CH3结构域包括来自IgA CH3结构域和IgG CH3结构域的序列。26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述双特异性抗体是结构域交换抗体，其中所述HC与所述LC二聚化。27.如权利要求24
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26所述的方法，其中...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷钢，
申请(专利权)人：苏特罗生物制药公司，
类型：发明
国别省市：