Sirt5，一种线粒体去乙酰化酶，在本发明专利技术中其被鉴定具有脱丙二酰和脱琥珀酰活性。基于Sirt5强的酶活性，本发明专利技术公开了一种鉴定Sirt5调节剂的方法。特异性的Sirt5调节剂可以被用于Sirt5的生物功能的研究，也可以靶向Sirt5活性用于治疗人类疾病。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是申请号为201180043047.0、申请日为2011年7月7日、专利技术名称为 ""的中国专利技术专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为 PCT/US2011/043130的国家阶段申请，该国际申请要求申请日为2010年7月7日、申请号为 61/362, 078的美国临时申请的优先权。 夺叉引用美国相关专利申请 本专利技术要求美国临时专利申请的优先权（【申请号】N0. 61/362,078,申请日：2010 年7月7日），在此将其作为参考文献整体引用并到本专利技术中。 关于美国联邦咨助研究的说明 本专利技术得到美国政府的资助，获得NIH基金，合同号为GM086703。因此政府拥有本 专利技术的某些权利。 发曰月背景 沉默信息调控蛋白2(Sir2)或者叫去乙酰化酶（Sirtuins)，是一个具有辅酶 (nicotinamideadeninedinucleotide，NAD)依赖蛋白去乙酰活性的进化保守的酶家 族(A.A.Sauve,etal. ,Annu.Rev.Biochem. 75:435 (2006) ；S. -i.Imai,etal. ,Trends inPharmacologicalSciences31:212 (2010) ；M.C.Haigis,etal. ,AnnualReview ofPathology:MechanismsofDisease5:253(2010)).自从最初发现sirtuin的去乙 酰活性（S.-i.Imai，etal.，Nature403:795(2000) ;K.G.Tanner,etal.，ProcNatl. Acad.Sci.U.S.A. 97:14178(2000))，揭示了sirtuins的很多重要的生物功能，并且也很 好的理解了NAD依赖的去乙酰机制（S. _i.Imai，etal.，TrendsinPharmacological Sciences31:212 (2010) ；M.C.Haigis,etal. ,AnnualReviewofPathology:Mechanisms ofDisease5:253 (2010))。基于序列的相似性，sirtuins被分为不同的类型 (R.A.Frye,Biochem,Biophys.Res.Commun. 273:793 (2000))。哺乳动物有 7 种sirtuins， Sirtsl-7。Sirtsl-3属于第一类，Sirt4属于第二类，Sirt5属于第三类，Sirt6和Sirt7属 于第四类（R.A.Frye,Biochem.Biophys.Res.Commun. 273:793 (2000))。 研究sirtuin活性的一个主要障碍在于7种人类sirtuins中的4种（Sirt4_7) 要么有非常弱的去乙酰活性，要么没有去乙酰活性（E.Michishita，etal.，Mol.Biol.Cell 16:4623(2005) ；M.C.Haigisetal.,Cell126:941(2006) ；A.Schuetzetal. ,Structure 15:377 (2007) ；G.Liszt,etal. ,J.Biol.Chem. 280 : 21323 (2005) ；E.Michishitaet al. ,Nature452:492(2008))。这对研究Sirtuins和开发调节他们活性的小分子带来了许 多困难。比如，由于没有强活性检测方法，所以难以开发以Sirts4-7为靶点的抑制剂或激 活剂。也难以确认以Sirtl、Sirt2和Sirt3为靶点的抑制剂或激活剂是否也同样作用于 Sirts4_7〇 专利技术概沐 Sirt5, 一种线粒体去乙酰化酶，被发现是一种有效的脱丙二酰和脱琥珀酰酶。这 个发现证明了哺乳动物线粒体蛋白新的翻译后进行修饰的过程，即赖氨酸残基的丙二酰化 和琥珀酰化。Sirt5去除线粒体蛋白赖氨酸残基上的戊二酰，丙二酰和琥珀酰基团，这个过 程被认为可以可逆的调节线粒体蛋白的活性。由于发现了这个强酶活性，使得能够开发识 别Sirt5调节剂的方法。Sirt5特异性的调节剂可被用于研究Sirt5的生物功能和革巴向 Sirt5活性用于治疗人类疾病。 附图简沐 图1 :使用AMC-琥珀酰肽来测试Sirt5的荧光实验。 图2A-2D:Sirt5的结构揭示了一个不寻常的酰基袋。（A)Sirt5的酰基袋被CHES 的缓冲分子与Argl05和Tyrl02相互作用产生的硫酸盐部分占据。所述硫酸酯距离硫代乙 酰基团4.2A。.⑶Sirt5-硫代乙酰肽结构和Sir2Tm-乙酰肽结构的对比。（C)理论预测丙二 酰/琥珀酰肽可能是Sirt5更好的底物。（D)Sirt5-琥珀酰肽-NAD三重结构表明琥珀酰基 团和Tyrl02和Argl05的相互作用。 图3A-3F:Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰赖氨酸的水解。纯化的去乙酰化酶（Sirtl 0. 75yM或Sirt5 3. 3yM)和0. 3mM的酰基肽一起孵育，1.OmMNAD加到含有ImMDIT的 60yL的 20mMTris-HCl缓冲液中（pH7. 5)，在 37°C反应 2 小时。反应用 60yL10%TFA 终止。去除沉淀的蛋白后，使用LCMS分析反应混合物。灰色曲线表明酰基肽的质量（乙 酰肽，m/z1274. 0 ;丙二酰肽，m/z1318. 0 ;琥珀酰肽，m/zl332. 0)和脱乙酰肽的质量（m/z 1232. 0)的离子峰强度（10x放大）。黑色曲线表明所有从100-2000的质量（总离子数或 者TIC)的离子峰强度。对于Sirtl，当H3K9乙酰肽（A)作为底物时可检测出脱乙酰产物， 当使用H3K9丙二酰（B)和琥珀酰（C)肽时没有水解产物被检出。对于Sirt5,脱乙酰产物 很少被检出（D)，而脱丙二酰（E)和脱琥珀酰（F)产物可以被检出。 图4A-4B:(A)琥珀酰赖氨酸残基存在于牛肝脏线粒体中。使用32P-NAD可以 检出Sirt5催化的丙二酰和琥珀酰肽的水解，形成32P标记的0-Ma-ADPR(条带2)和 0-Su-ADPR(条带3)。用乙酰肽则没有反应发生（条带1)。当组蛋白被用作乙酰赖氨酸 (条带8)或H3K9乙酰肽（条带4)的来源时，Sirtl催化的0-Ac-ADPR的形成可以被检测 出来。当用32P_NAD和Sirt5孵育被胰蛋白酶消化的牛肝脏线粒体肽时形成0-Su-ADPR(条 带9)，但用Sirtl则不能形成（条带10)，这表明琥珀酰赖氨酸残基存在于牛肝脏线粒体肽 提取物中。作为对照组的用BSA肽和Sirt5的反应不会产生0-Su-ADPR(条带12)。⑶38 能水解NAD产生ADPR，它被用来产生在第13条带上的标准32P-ADPR点。（B)Sirt5的缺失 可以增加老鼠肝脏部位的CPS1琥珀酰水平。在野生型或Sirt5敲除的肝脏中免疫沉淀出 CPS1，用32P-NAD检测出琥珀酰化水平。合成的乙酰，丙二酰和琥珀酰肽可被用来分别产生 对照点 0-Ac-ADPR，0-Ma-ADPR和 0-Su-ADPR。 图5A-5C:Sirtl和Sirt5催化的H3K9肽㈧脱乙酰化，⑶脱丙二酰化和（C)脱 琥珀酰化通过HP本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抑制Sirt5脱丙二酰或脱琥珀酰活性的化合物，所述化合物具有下式：其中：R1是阴离子或可电离基团；R2选自S、NR5、和O，其中R5是H、甲基、乙基、异丙基、苯基、或苄基；当R1是羧基时，则R2不是O，并且当R2是O时，则R1不是羧基；X0、X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7独立地选自‑(CH2)n‑(其中n表示1、2、或3)、‑NR5‑、‑O‑、‑S‑或键，条件是X0‑X4中至少一个不是键，并且X5‑X7中至少一个不是键；R3和R4独立地选自H、碳氢化合物(R)、氨基酸、二肽、三肽、寡肽、蛋白质、核碱基、核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、寡核苷酸、单糖、二糖、寡糖、和保护基团，或其组合或其修饰形式。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：林合宁，
申请(专利权)人：康奈尔大学，
类型：发明
国别省市：美国;US
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