本发明专利技术公开了一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，采用以下步骤制备：将酸酐用二甲基亚砜配制成浓度为1M的母液；配制0.1M的磷酸氢二钠溶液，用于制备蛋白溶液，蛋白浓度为20mg/ml；将酸酐溶液加入待修饰的蛋白溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；重复进行上述酸酐与蛋白溶液混合过程，最终使蛋白溶液中酸酐的终浓度为60mM，溶液pH9.0，25℃孵育2h，完成酸酐化反应；将酸酐化蛋白溶液装入透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析48h，将酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一类医药
中新型抗病毒生物制剂，具体为一种预防和控制埃 博拉病毒感染的生物制剂。
技术介绍
埃博拉病毒病（Ebolavirus disease，EVD)是由埃博拉病毒（Ebolavirus，ElBOV) 感染引起的经体液或密切接触传播的病毒性传染病。埃博拉病毒在自然界的保存宿主是果 蝠，主要对包括人类在内的灵长类致病，自上世纪七十年代发现埃博拉病毒以来，该病毒感 染已经零星在中非地区有过局部爆发，但从2014年蔓延到今年的西非埃博拉疫情远超历 史上任何一次爆发，据世卫组织统计，截至2015年4月8日，总感染人数为25550人，其中超 过10587人死亡。该病的潜伏期为2至21天，早期症状为发热、胃肠道不适、肌肉疼痛等， 随着病情的发展，逐渐出现内外出血、极度虚弱等症状，最后发展为肝肾等脏器衰竭。 埃博拉病毒属于丝状病毒科（Filoviridae)，目前发现的埃博拉病毒有五 种型，分别是 Zaire ebolavirus(ZEBOV)，Sudan ebolavirus (SEBOV)，Bundibugyo ebolavirus(BEBOV)，Tai Forest ebolavirus (TFEBOV)和 Reston ebolavirus(REBOV)。其 中Zaire和Sudan型埃博拉病毒的致病性最高，并且是历史上造成埃博拉流行的主要病毒 型，本次疫情中流行的埃博拉病毒也属于Zaire型。埃博拉病毒在自然界中有特定的保存 宿主和完整的感染循环，所以不能像天花病毒一样通过在人群中预防接种疫苗而被灭绝， 非洲独特的自然环境、风俗习惯和相对落后的公共卫生体系是造成埃博拉在非洲爆发的重 要因素，每次埃博拉疫情基本都源于人类与携带病毒的野生动物的接触。由于人类与野生 动物接触而感染病毒属于随机事件，无法预测下一次疫情出现的时间和地点，而全球一体 化的进程使得每次疫情都可能向全球蔓延，例如本次疫情已经波及欧洲和美洲。 目前防控埃博拉疫情主要依靠诊断和隔离，对病人采取对症支持治疗。针对该病 的特效药物和疫苗都处于临床前或临床试验阶段。一些抗埃博拉药物在先期临床试验中已 经显示出比较好的疗效，其中最著名的是抗体类药物ZMapp，但ZMapp用于治疗存在以下两 个问题。首先，ZMapp由三种针对Zaire型埃博拉病毒的中和抗体组成，能否在未来可能爆 发的疫情中针对变异后的抗原或是其他型别的埃博拉病毒产生有效保护，还未能证实；其 次，ZMapp的生产工艺比较复杂，成本较高，且需要较完备的储存、运输条件，因此如何在非 洲经济相对落后的国家用于疫情控制也是一个难题。 因此，研发一种安全、有效（同时针对不同型别的埃博拉病毒)、廉价(在非洲及广 大欠发达地区能广泛使用)，易于长期储存(可作为战略储备药物）的药物对于控制未来可 能出现的埃博拉疫情十分重要。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对抗埃博拉病毒药物的缺乏和不足状况，提供一种新型的预防 和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物药物制剂。通过设计蛋白质多肽类的病毒进入抑 制剂，阻断埃博拉病毒进入其靶细胞，使人体细胞免于病毒感染，从而起到预防和控制病毒 感染的目的。使用活性酸酐来修饰和封闭经纯化的蛋白质表面带正电荷的氨基酸，从而使 修饰后的蛋白具有阻断多种基因型的埃博拉病毒进入和感染靶细胞的活性，成为抗埃博拉 候选药物。 本专利技术是采用如下技术方案实现的： 一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，采用以下步骤制备： (1) 、将3-羟基-邻苯二甲酸酐用二甲基亚砜配制成浓度为IM的母液； (2) 、配制浓度为0. lM、pH为8. 5的磷酸氢二钠溶液，人血清白蛋白加入磷酸氢二钠溶 液制成HSA溶液，HSA溶液浓度为20mg/ml; (3) 、将母液加入待修饰的HSA溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用 NaOH溶液调节蛋白溶液pH至9. 0, 25°C孵育20min; (4) 、重复进行步骤（3)所述的母液与HSA溶液混合过程，最终使HSA溶液中酸酐的终 浓度为60mM，调节蛋白溶液pH至9.0，25°C孵育2h，完成酸酐化反应； (5) 、将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7. 5KDa的透析袋中，置于pH7. 4的磷酸盐缓冲液 中透析换液，4°C下透析48h，将酸酐化蛋白溶液用0. 45 ym微孔滤膜过滤，于4°C保存，即可 按照常规方法制成各种剂型的成品。 所述3_羟基-邻苯二甲酸酐（HP)可以用马来酸酐（maleic anhydride，缩写为 ML)或者琥I自酸酐（succinic anhydride，缩写为SU)代替。 所述人血清白蛋白（HSA)可以用牛血清白蛋白（bovine serum albumin，缩写为 BSA)、牛(6-乳球蛋白（0-lactoglobulin，缩写为0-LG)、鼠血清白蛋白（mouse serum albumin，缩写为 MSA)、卵清蛋白（ovalbumin，缩写为 OVA)、RNA 酶 I (RNaseI)或者 RNA 酶 7 (RNase7)代替。 上述生物制剂具有在制备预防和控制Zaire型和Sudan型埃博拉病毒的药物中的 应用。 -、酸酐修饰蛋白浓度测定 将上述制备得到的酸酐化蛋白样品按照BCA蛋白浓度分析试剂盒的操作步骤测定浓 度，具体方法如下： (1) 使用PBS溶液稀释蛋白标准品（BSA)，使BSA终浓度为0、0. 1、0. 2、0. 4、l、2mg/mL ; (2) 分别将20 y 1各浓度标准品和20 y 1待测样品（使用PBS进行稀释）加入96孔板 中； (3) 制备BCA工作液，将A液与B液按1 :50比例混匀； (4) 每孔加入200 y 1工作液，轻柔混匀，37°C孵育20min ; (5) 待冷却至室温后，使用酶标仪在562nm处读取各空吸光度； (6) 根据蛋白标准品OD读数，使用Excel和SigmaPlot软件绘制蛋白浓度标准曲线，如 图5所示，根据标准曲线及对应公式计算酸酐化蛋白样品浓度。 二、埃博拉假病毒的制备 (1)分别对 2014 年 Zaire 型埃博拉病毒株（GenBank :KM034549. 1)和 2012 年 Sudan 型埃博拉病毒株（Genebank :KC545389. 1)的包膜蛋白（GP蛋白）基因序列进行密码子优化， 并进行基因合成。Zaire型GP蛋白基因合成序列记为"合成基因1"（碱基序列见序列表)， Sudan型GP蛋白基因合成序列记为"合成基因2"（碱基序列见序列表)。 (2)运用分子克隆的方法将合成基因1与合成基因2分别装载于pcDNA3. 1 (Invitrogen)表达载体的多克隆位点上，重组质粒分别命名为pcDNA3.I-Zaire-GP和 pcDNA3.I-Sudan-GP ;将鉴定正确的重组质粒保存于ToplO大肠杆菌菌株中。 (3)使用终浓度10%胎牛血清的DMEM培养基在T75细胞培养瓶中培养人胚肾 细胞HEK293T。当细胞生长接合度约为70%时，更换无血清的DMEM培养基，37 °C继续培 养lh。将210y 1的PEI转染试剂（I y g/y 1)与3y g的pcDNA3. I-Za本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种预防和控制多种基因型埃博拉病毒感染的生物制剂，其特征在于：采用以下步骤制备：（1）、将3‑羟基‑邻苯二甲酸酐用二甲基亚砜配制成浓度为 1M的母液；（2）、配制浓度为 0.1M、pH为8.5的磷酸氢二钠溶液，人血清白蛋白加入磷酸氢二钠溶液制成HSA溶液，HSA溶液浓度为20mg/ml；（3）、将母液加入待修饰的HSA溶液中，使加入的酸酐终浓度为12mM，充分混匀后，用NaOH溶液调节蛋白溶液pH至9.0，25℃孵育20min；（4）、重复进行步骤（3）所述的母液与HSA溶液混合过程，最终使HSA溶液中酸酐的终浓度为60mM，调节蛋白溶液pH至9.0， 25℃孵育2h，完成酸酐化反应；（5）、将酸酐化蛋白溶液装入截留量为7.5KDa的透析袋中，置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中透析换液，4℃下透析48h，将酸酐化蛋白溶液用0.45μm微孔滤膜过滤，于4℃保存，即可按照常规方法制成各种剂型的成品。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姜世勃，陆路，李浩洋，于飞，王茜，杨霞，
申请(专利权)人：山西锦波生物医药股份有限公司，复旦大学，
类型：发明
国别省市：山西;14
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