本发明专利技术提供了一种用于肺癌早期诊断的基于半导体量子点的微芯片及其用于制备检测从高危人群外周血血清中提取的循环miRNA的DNA探针的方法。所述半导体量子点作为微芯片的荧光检出信号，所述半导体量子点是粒径为3-6nm多壳层结构的Cd/Ge半导体量子点，其外壳层为选自CdS、ZnS的无机层包覆。本发明专利技术针对肺癌发生早期的7-38个循环microRNA，采用改进的杂交法和DNA-量子点荧光信号检测血清中的低丰度miRNA，形成适合临床诊断应用的、符合国家体外诊断试剂及质量控制规范的检测系统。本发明专利技术将量子点纳米技术与微芯片技术结合，提供适于肺癌血清早期诊断的循环miRNA检测系统，依据肺癌miRNA的表达谱，在疾病早期区分病变的良恶性，将使早期肺癌患者得到及时治疗，提高生存期。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于肺癌早期诊断的基于半导体量子点的微芯片及其用于制备检测循环HiiRNA的DNA探针的方法。
技术介绍
肺癌是对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤，也是恶性肿瘤死亡的首要原因。肺癌的高死亡率主要由于缺乏有效的早期诊断方法，80%的肺癌患者确诊时已属局部晚期或发生远处转移。目前临床上常用的早期诊断方法为肿瘤标志物、胸部CT和PET/CT等。肺癌的血清肿瘤标志物检测如CEA、Cyfra21-1、NSE、SCC等由于敏感性和特异性均不理想，多无法用于肿瘤的早期诊断，只能作为治疗监测的参考指标。胸部CT是肺癌最主要的无创性诊断方法，然而肺癌的影像学征象常与某些肺部疾病相似或并存，且直径Icm以下的病灶不易显示，故易出现误诊、漏诊。PET/CT能反映分子代谢的显像，有助于区分病变的良恶性，但尚无法鉴别Icm左右病灶的良恶性。因此，上述的诊断方法对肺癌的早期诊断均存在局限性。microRNA (miRNA)是一类长度为19-24个核苷酸的非编码小分子RNA，已经被公认为是生物体内最重要的调控分子之一。本专利技术的专利技术人已对肺癌血清的miRNA表达谱进行了高通量检测。通过对正常人与Ι、Π期肺癌患者的血清进行miRNA芯片对照分析发现，共15种miRNA在肺癌中上调，23种miRNA表达下调，其中有12种miRNA尚未在现有文献中报道。专利技术人依据这些前期研究结果将38种与肺癌密切相关的miRNA制成芯片进行检测。以微阵列芯片为代表的杂交法提供了高通量的miRNA检测手段，但由于循环miRNA的含量非常低，传统的微阵列芯片检测miRNA需要至少20-50mL血样，其检测灵敏度尚不适合于痕量(<50ng)循环microRNA检测，尤其不适合于临床筛查和诊断的目的。
技术实现思路
本专利技术为解决现有技术中的上述问题提出的。本专利技术的一个目的是提供了一种用于肺癌早期诊断的基于半导体量子点的微芯片，检测标本为高危人群外周血血清，针对肺癌发生早期的7-38个循环microRNA，采用改进的杂交法和DNA-量子点荧光信号检测血清中的低丰度miRNA，形成适合临床诊断应用的、符合国家体外诊断试剂及质量控制规范的检测系统。本专利技术的第二个目的是提供了一种如上所述基于半导体量子点的微芯片用于制备检测循环miRNA的DNA探针的方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案:本专利技术的第一个方面是提供一种用于肺癌早期诊断的基于半导体量子点的微芯片，所述半导体量子点作为微芯片的荧光检出信号，所述半导体量子点是粒径为3-6nm多壳层结构的Cd/Ge半导体量子点，所述半导体量子点的外壳层为选自CdS、ZnS的无机层包覆。在上述微芯片中，优选地，所述半导体量子点表面经过高分子材料修饰和/或惰性蛋白修饰。其中，所述高分子材料优选地包括聚乙二醇(PEG)、多羟基醇，所述惰性蛋白为牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)。半导体量子点是一种由I1-VI族或II1-V族元素组成的，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米晶。量子点作为新型的荧光材料与传统的有机染料荧光物质相比较，主要优点是，激发普为连续谱带，发射光谱较窄，发射光谱半峰宽通常仅为30nm左右，荧光效率高，且量子点的抗光漂白性和光稳定性要远高于传统的有机染料分子，其优异的光学性质使其在能量转移、免疫荧光诊断、细胞成像、活体成像等生物学医学领域的应用已显示出极大的发展潜力，引起国际上的普遍重视。本专利技术采用粒径为3_6nm的Cd/Ge半导体量子点，其纳米尺寸效应机理为:量子点的独特性质基于它自身的量子效应，当颗粒大小到达纳米级时，尺寸限域将引起尺寸效应、量子限域效应、宏观量子隧道效应和表面效应，从而展现出许多不同于宏观块体材料的物理化学性质。当半导体量子点的尺寸达到纳米级时，由于电子和空穴被量子限域，连续能带变成具有分子特性的分立能级结构，受激发可以发射荧光，通过控制半导体量子点的形状、结构和尺寸，就可以方便地调节其能隙宽度、激子束缚能的大小以及发射荧光波长等。本专利技术的第二个方面是提供一种如上所述基于半导体量子点的微芯片在肺癌早期诊断中的应用，所述基于半导体量子点的微芯片检测肺癌患者外周血血清中的低丰度循环 miRNAο本专利技术的第三个方面是提供一种如上所述基于半导体量子点的微芯片用于制备检测循环miRNA的DNA探针的方法，其特征在于，设计待测循环miRNA的DNA探针，DNA探针的上段为miRNA探针序列，下段为量子点探针序列，量子点的荧光强度与miRNA量成正比例相关。在上述制备检测循环miRNA的DNA探针的方法中，优选地，步骤包括:步骤1，将DNA探针点样或原位合成于固相基质上，列为点阵；步骤2，用从外周血血清中提取的循环miRNA样品杂交洗涤，使miRNA结合在所述DNA探针的上段；步骤3，用单链核酸外切酶ExoVII消化，使未结合miRNA的DNA探针被切除，而结合了 miRNA的DNA探针仍然固着于固相基质上；步骤4，与表面偶合通用DNA序列的半导体量子点杂交，使DNA-量子点结合在所述DNA探针的下段；步骤5，将所得的DNA探针进行荧光信号强度分析。本专利技术采用的粒径3_6nm多壳层结构的Cd/Ge半导体量子点作为微芯片的荧光检出信号，具有优良的荧光效率和抗荧光淬灭能力；并通过量子点表面PEG亲水性改性，消除量子点非特异性吸附和降低量子点杂交空间位阻，以提高量子点微芯片的检查特异性和灵敏性；用BSA蛋白包裹的量子点具有极好的亲水性、胶体稳定性、抗非特异性吸附能力，以及水合直径小、荧光效率高等优点；在制备检测循环miRNA的DNA探针的过程中，量子点表面偶合通用DNA序列，可适合多种目标物检测，具有普适性。本专利技术着重考虑量子点本身结构及其表面微环境，通过一系列纳米合成和表面修饰手段，以提高目标物的检测灵敏度和特异性，使其适合于痕量循环miRNA检测ο本专利技术采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果:本专利技术的目的是提供一种用于肺癌早期诊断的基于半导体量子点的微芯片，检测标本为高危人群外周血血清。为了适应血清内低丰度miRNA的检测，与传统的杂交芯片法相比，本专利技术具有如下技术效果:I)本专利技术利用特定设计的微芯片DNA探针，样品中提取到的miRNA无需事先标记，而是直接与微芯片杂交，避免了痕量miRNA进行荧光基团的化学标记，然后杂交。由于标记过程的操作和质控的不确定性，故传统芯片杂交法无法用于血清miRNA检测。2)本专利技术在芯片杂交过程中采用了单链核酸外切酶ExoVII消化技术，最大程度地消除了非特异性吸附对测定结果的影响，同时保证了杂交的碱基特异性，可检出单碱基差异，极大地改善了测定的准确度和精密度。3)本专利技术采用DNA-纳米量子点作为检测荧光信号，DNA-量子点可杂交在芯片探针的下段互补序列上，具有高效、灵敏、稳定的特点，可满足对低丰度miRNA检测的灵敏度。目前，随着临床上螺旋CT及薄层CT的广泛应用，肺部小结节的检出率较以往大大增加，在有1000例患者进行最初基线CT扫描的ELCAP研究中，233例受检者(23.3% )存在1-6个非钙化结节，但是很难用CT来识别肺癌，因此结节良恶性的鉴别成为临床上所面临的一大难题，大部分患本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于肺癌早期诊断的基于半导体量子点的微芯片，其特征在于，所述半导体量子点作为微芯片的荧光检出信号，所述半导体量子点是粒径为3‑6nm多壳层结构的Cd/Ge半导体量子点，所述半导体量子点的外壳层为选自CdS、ZnS的无机层包覆。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：范理宏，粟波，陈昊，
申请(专利权)人：上海市肺科医院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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