本发明专利技术涉及多肽合成领域，特别涉及一种制备利那洛肽的方法。本实验采用片段法进行利那洛肽肽链的合成，并且完全选择性的分三步形成三对二硫键，具体步骤为：a)合成片段I线性肽；b)形成第一对二硫键，得到片段I氧化肽；c)合成片段Ⅱ肽树脂；d)合成含一对二硫键的利那洛肽粗肽；e)合成第二对二硫键；f)合成第三对二硫键。本方法采用完全选择性分三步形成三对二硫键的方法制备利那洛肽，可以避免产生二硫键错配的异构体杂质，降低了纯化过程的难度，同时片段法降低了第一对二硫键形成的难度，使最终所得粗肽纯度与收率均较高，操作过程简便，适于大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及多肽合成领域，特别涉及。 技术背景 利那洛妝（LINZESS)是由美国 Ironwood Pharmaceuticals 公司研发，于 2012 年 12月17日首次获批在美国上市的一种用于治疗胃肠道疾病的多肽类药物，并于2013年先 后在丹麦、芬兰、德国、挪威、瑞典及英国等国家上市，目前暂未申报进口中国（但是已在中 国做国际多中心临床III期试验）。本品是FDA唯一批准的可用于临床的肠道局部起效的 GC-C (鸟苷酸环化酶-C)激动剂类药物，也是欧洲首个获批用于治疗中重度IBS-C成人患者 新型处方药物。利那洛肽胶囊（LINACLOTIDE capsules)规格为：145MCG/粒；290MCG/粒。 利那洛肽是由14个氨基酸残基组成的含有三对二硫键的多肽，其结构如下： 文献 Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Peptide Linaclotide，Peptide Science Volume 96，Number l，p69 报道了利那洛肽的合成方法，该 文献中主要介绍了以下三种利那洛肽的合成策略：（1)采用6-Trt的保护策略，通过Fmoc 固相法合成利那洛肽线性粗肽后，在溶液中一步氧化形成三对二硫键，但由于选择性差，粗 肽中存在多种二硫键错配异构体杂质，导致目标肽收率较低；（2)采用2Mmt+2Acm+2Trt策 略，以Wang树脂为固相载体合利那洛肽全保护线性肽后，在保证Trt不被脱除的情况下，脱 除Mmt，然后在树脂上氧化形成第一对二硫键，再将肽链从树脂上裂解下来，同时脱除Trt， 再分步氧化形成第二对和第三对二硫键，此方法选择性强，但在树脂上形成第一对二硫键 难度较大，导致粗肽纯度及收率都很低；（3)采用2StBu+4Trt保护策略，通过固相法合成利 那洛肽全保护线性肽后，先选择性脱去StBu，氧化形成第一对二硫键，然后再脱除全部保护 基，一步氧化形成第二对及第二对二硫，此方法中原料Fmoc-Cys (StBu)-OH价格较高，同时 粗肽中也存在多种二硫键错配异构体杂质。 专利 CN102875655A、CN104231051A、CN104628826A和 CN201410357720. 3 介绍了一 步氧化形成三对二硫键的方法：首先合成利那洛肽树脂，然后将利那洛肽树脂裂解脱除所 有保护基和树脂固相载体得到利那洛肽线性粗肽，最后对线性肽采用GSH/GSSH氧化体系 或其他氧化体系进行一步氧化反应；其中专利CN201410357720. 3公开了一种先以片段法 合成利那洛肽线性肽，然后再通过GSH/GSSH氧化体系一步氧化形成三对二硫键的方法。虽 然一步氧化法能够通过缓冲体系使线性肽尽量向目标结构转化，但仍然无法避免二硫键错 配异构体杂质的产生，收率较低。 专利CN103626849A公开了采用同一溶液体系，分步形成成三对二硫键，此法虽能 够避免二硫键错配异构体杂质的产生，但同一体系反应，处理过程复杂，且原料来源较少， 成本相对较高。 总之，在制备利那洛肽的过程中存在二硫键错配导致异构体杂质的产生以及第一 对二硫键形成难度较大的问题，本申请的技术方案不仅能够避免二硫键错配产生的异构体 杂质，降低了纯化过程的难度，而且片段法有利于第一对二硫键的形成，使最终所得粗肽纯 度与收率均较高，本法操作过程简便，适于大规模生产。
技术实现思路
为解决合成过程中存在的以上问题，本专利技术提供了，本 专利技术提供的技术方案如下： -种制备那洛肽的方法，包括如下步骤： (a)固相合成片段I线性肽：以CTC树脂为固相载体，通过Fmoc固相合成法合成 片段I肽树脂，经裂解反应，得到片段I线性肽，其结构如下： Fmoc-Cys-Cys(Acm)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Cys(Trt)-Cys-OH (b)第一对二硫键形成：将片段I线性肽溶解在溶液中氧化形成第一对二硫键，得 到片段I氧化肽，其结构如下： (c)固相合成片段II肽树脂：以Wang脂或CTC树脂作为固相载体，通过Fmoc固相 合成法合成片段II肽树脂，其结构如下： H-Asn(Trt)-Pro-Ala-Cys(Acm)-Thr(tBu)-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Resin (d)含一对二硫键利那洛肽的合成：片段I氧化肽经缩合试剂活化后，与片段II肽 树脂偶联并脱除Fmoc保护基，经裂解反应，得到含一对二硫键的利那洛肽粗肽，其结构如 下： (e)第二对二硫键的形成：将上述粗肽溶解在溶液中，调节pH，加入氧化剂氧化形 成第二对二硫键，其结构如下： (f)第三对二硫键的形成：在上步溶液中加入AcOH，混和均匀后，再加入I2进行搅 拌反应，最后加入Vc还原过量的I 2，终止反应，氧化形成第三对二硫键，其结构如下： 优选的，步骤（a)中，操作过程为：第6位保护氨基酸Fmoc-Cys (Mmt) -OH 与CTC树脂反应，制得Fmoc-Cys (Mmt) -CTC树脂，然后在缩合试剂的作用下逐一偶 联 Fmoc-Cys(Trt)-〇H、Fmoc-Tyr(tBu)-〇H、Fmoc_Glu(OtBu)-〇H、Fmoc_Cys(Acm)-〇H、 Fmoc-Cys(Mmt)-OH获得片段I肽树脂；将片段I肽树脂加入到裂解液中，20-25°C下反应 3-5min，重复裂解3-5次；反应结束，将裂解液过滤并合并到一起；用0. 1-1. Omol/L NaHCO3 水溶液洗涤裂解液，直至pH为7-8 ;旋蒸浓缩裂解液，过滤收集析出的沉淀，真空干燥得片 段I线性肽； 更为优选的，上述步骤中的裂解液为加入体积比1-10% TFA及体积比1-5% TIS 的DCM溶液； 步骤（b)中，氧化形成第一对二硫键的条件为：将片段I线性肽溶解在溶剂中，形 成浓度为〇· 5-5. Omg/mL的溶液，用氨水调节溶液pH值至7. 0-8. 0,以DMSO, H2O2,或空气中 的任意一种为氧化剂，氧化反应10_20h，旋蒸浓缩反应液，过滤收集析出的沉淀，真空干燥 得片段I氧化肽； 优选的，单独用DMSO做氧化剂时用量为溶液体积的5-30%，单独用H2O 2做氧化剂 时的用量为溶液体积〇. 05-0. 5%的30% H2O2溶液，单独采用空气做氧化剂时采用通入的方 式； 步骤（c)中，片段II肽树脂的合成过程为：第14位保护氨基酸Fmoc-Tyr (tBu) -OH 与载体树脂反应，制得Fm〇C-Tyr(tBu)-树脂，然后在缩合试剂的作用下逐一偶联 Fmoc-Cys (Trt)-OH、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Thr (tBu)-OH、Fmoc-Cys (Acm)-OH、Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Asn (Trt) -〇H，获得片段 II 肽树脂； 步骤（d)中，含一对二硫键利那洛肽的合成过程为：片段I氧化肽与与片段II肽树 脂在缩合试剂的作用下，发生接肽反应，生成含一对二硫键的利那洛肽肽树脂，然后再用裂 解剂进行l_3h裂解反应，最后过滤裂解液，经甲叔醚沉降洗涤，真空干燥得含一对二硫键 的利那洛肽粗肽； 更为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备利那洛肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)固相合成片段I：以CTC树脂为固相载体，通过Fmoc固相合成法合成片段I肽树脂，经裂解反应，得到片段I线性肽，其结构如下：Fmoc‑Cys‑Cys(Acm)‑Glu(OtBu)‑Tyr(tBu)‑Cys(Trt)‑Cys‑OH(b)第一对二硫键形成：将片段I线性肽溶解在溶剂中氧化形成第一对二硫键，得到片段I氧化肽，其结构如下：(c)固相合成片段Ⅱ肽树脂:以Wang脂或CTC树脂作为固相载体，通过Fmoc固相合成法合成片段Ⅱ肽树脂，其结构如下：H‑Asn(Trt)‑Pro‑Ala‑Cys(Acm)‑Thr(tBu)‑Gly‑Cys(Trt)‑Tyr(tBu)‑Resin(d)含一对二硫键利那洛肽的合成：片段I氧化肽经缩合试剂活化后，与片段Ⅱ肽树脂偶联并脱除Fmoc保护基，经裂解反应，得到含一对二硫键的利那洛肽粗肽，其结构如下：(e)第二对二硫键的形成：将上述粗肽溶解在溶剂中，调节pH，加入氧化剂氧化形成第二对二硫键，其结构如下：(f)第三对二硫键的形成：在上步溶液中加入AcOH，混和均匀 后，再加入I2进行搅拌反应，最后加入Vc还原过量的I2，终止反应，氧化形成第三对二硫键，其结构如下：。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张颖，王德龙，王仁友，李同金，石鑫磊，
申请(专利权)人：济南康和医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37
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