一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法技术

本发明专利技术公开了一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法，属于SNP检测技术领域。包括以下步骤：1)测定待测基因组的单核苷酸多态性SNP；2)为每个待测基因组的SNP中所有的等位基因设计互补的特异性引物；3)设计正向通用引物：设计不与特异性引物发生互补且能够避免自身的回文结构或茎环结构；4)以步骤2)和步骤3)所设计的引物，添加模板、纳米金胶液、蛋白质、缓冲液及各种所需的酶，混合均匀后进行实时等温扩增，得到高准确度单核苷酸多态性SNP位点信息。该方法能够实现简单、快速、高准确率的SNP检测，从而有效解决现有扩增技术中3’端碱基错配延生而造成的准确率不高、检测成本高的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于SNP检测
，涉及一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测 方法。
技术介绍
单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP)是指基因组序列上单 个核苷酸的变异，包括转换、颠换、缺失和插入。SNP通常只有两个等位基因，三个或者四个 出现的频率极低。SNP在人类基因组中分布广泛，大约每500~1000个碱基对就有一个SNP 位点，总数量超过300万个。人群基因组序列不到1 %的变异在很大程度上决定了个体之间 的差异。而SNP占人类所有变异的90%以上，有极大的生物医学研宄价值。SNP研宄有助 于我们寻找新的遗传病的致病基因或易感基因，认识人种、人群、个体间的遗传差异，以及 疾病和药物反应与个体差异的关系。因此，SNP作为遗传标记具有高多态性、遗传稳定、基 因组分布广、信息量大等诸多优点。 目前，检测SNP的金标准是测序，包括常规测序、焦磷酸测序等。测序的方法需要 样本基因组提取，PCR扩增，纯化，测序等步骤。测序的方法虽然是金标准，而且能检测已知 SNP和未知SNP，但是其步骤多、成本高、周期长、价格贵。 除了测序这种方法，等位基因特异性PCR(allele-specific PCR，ASPCR)也是一种 经典的区别等位基因的方法。此方法利用缺少3'_5'外切活性的taq DNA聚合酶和特殊设 计的引物对（等位基因的正向通用引物和反相特异性引物）来区分SNP。以检测二等位基 因为例，扩增反应前，分别向两个PCR反应体系中加入一对特异性引物和通用引物，当特异 性引物的3'端碱基与等位基因互补时，扩增反应进行；当引物3'端碱基与该位点错配时， 扩增停止或者效率降低。通过检测PCR产物的有无和量来检测等位基因。 如今，等温扩增已成为非常有潜力的PCR的替代方法。等温扩增例如依赖解旋酶 DNA等温扩增技术（Helicase-dependent Amplification, HDA)能够快速、有效地在恒定温 度下实现信号放大，不需要精确的热循环过程。相比于传统PCR，等温扩增技术快速、简便、 易实现微型化，而且其检测灵敏度可与PCR相媲美，展示了该技术在生物学研宄和诊断的 巨大潜力。 依赖解旋酶DNA等温扩增技术模拟生物体内DNA复制过程，利用解旋酶在恒 温条件下解开DNA双链，与此同时DNA单链结合蛋白（single-stranded DNA-binding protein, SSB)结合在刚形成的单链上，稳定单链，这时引物与单链模板结合，在Bst 2. ODNA聚合酶的帮助下延伸。新合成的双链又在解旋酶和单链结合蛋白的作用下形成单 链，进入上述的循环扩增，最终实现目的序列指数式扩增。 到目前为止，还未见将HDA用于基因组SNP检测的报道。HDA能否用于基因组SNP 检测还不得而知。 基于等温扩增的以上优点，使用该技术来检测基因组SNP也许是一个很好的选 择，但是在使用几种典型的 DNA 聚合酶（Bst 2.0DNA polymerase，Klenow Fragment exo - 和Vent exo - DNA polymerase)来系统地评价所有12种3'端单碱基错配的等温扩增效率 后，我们发现碱基错配扩增这种现象，且该现象的扩增效率不仅与错配类型和位置有关，还 与DNA聚合酶的种类有关。除了几种错配类型（引物一模板：C 一 C，A - G，G - A和A - A)， 其他类型的碱基错配大部分能够有效地延伸并引发类似于沃森一克里克配对（Watson - Crick pairs)的扩增信号。这个现象给使用等温扩增技术准确检测SNP带来了困难。2007 年，Hayashizaki等人通过使用一种能与错配碱基特异性结合的蛋白和合理设计的非对称 引物来抑制碱基错配引发的延伸，使等温扩增技术能准确地检测人类基因组SNP，但是此方 法不仅过程复杂，且需要特殊的特异性错配结合蛋白，该蛋白价格昂贵，且不稳定，易失活， 提高了检测成本。因此，一种新颖、简单、便宜的可抑制碱基错配技术来作为一个替代方法 是迫切需要的。 2007年，李海阔等在PCR体系中加入纳米金（gold nano-particle, AuNP)，扩增特 异性得到显著提高。纳米金具有独特的物理和化学性质，已被广泛的用于生物检测中。另 外，纳米金对双链DNA和单链DNA展示了完全不同的亲和力：纳米金对单链DNA(引物）有 很强的吸附能力，而对双链DNA(引物一模板杂交复合体）的吸附能力很弱。因此，在扩增 体系中加入纳米金后，纳米金吸附引物分子，随着反应的进行，引物分子又能够释放到溶液 中，使溶液中的游离的引物浓度长时间保持在一个相对低的值。这样就减少了引物非特异 性结合模板或者引物二聚体的形成导致的非特异性扩增。 2011年，樊春海等在ASPCR体系中加入AuNP，有效地提高了单倍型分析的特异性， 单倍体PCR产物可直接用于SNP基因分型。目前为止，还未有在等温扩增体系中使用AuNP来提高扩增特异性的报道，AuNP是 否能在等温体系中发挥类似于在PCR这样的变温体系中的作用还不得而知。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供，该方法 能够实现简单、快速、廉价、高准确率的SNP检测，从而有效解决现有扩增技术中3'端碱基 错配延伸而造成的准确率不高或者检测成本高的问题。 本专利技术是通过以下技术方案来实现： ，包括以下步骤： 1)测定待测基因组的单核苷酸多态性SNP ; 2)为每个待测基因组的SNP中所有的等位基因设计互补的特异性引物； 3)设计正向通用引物：设计不与特异性引物发生互补且能够避免自身的回文结 构或茎环结构； 4)以步骤2)和步骤3)所设计的引物，添加模板、纳米金胶液、蛋白质、缓冲液及各 种所需的酶，混合均匀后进行实时等温扩增，得到高准确度单核苷酸多态性位点信息。 所述的纳米金胶液选用粒径为5nm的胶液。 实时等温扩增是在65°C下反应60min。 所述的特异性引物指3'末端的第一个碱基与目的DNA片段5'端的等位基因互 补而与另一个等位基因不互补，同时其他碱基与目的DNA片段完全互补的一条单链寡核苷 酸。 所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3所示。 步骤3)所述的正向通用引物的Tm值与特异性引物的Tm值接近。 所述的正向通用引物的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。 所述待测基因组为多倍体基因组。 所述待测基因组为两倍体基因组。 与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果： 1、本专利技术创新地用HDA这种等温扩增的方法来实现高准确度SNP检测，相比于要 求精确控制温度的PCR而言，不需要精密的温度控制设备，所需条件简单，能耗低。 2、本专利技术相比于传统方法，通过在等温体系中加入纳米金粒子，利用纳米金对双 链DNA和单链DNA的吸附能力的不同来达到高准确度检测SNP目的。扩增体系中的纳米金 特异性地吸附单链引物分子，使引物分子浓度保持在一个相对低的范围内，达到减少引物 的非特异性结合于模板或者形成引物二聚体的目的，从而抑制3'端碱基错配延伸，实现高 准确度的SNP检测。 3、本专利技术相比于Hayashizaki等人的向反应体系中加入价本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于纳米金颗粒的单核苷酸多态性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)测定待测基因组的单核苷酸多态性SNP；2)为每个待测基因组的SNP中所有的等位基因设计互补的特异性引物；3)设计正向通用引物：设计不与特异性引物发生互补且能够避免自身的回文结构或茎环结构；4)以步骤2)和步骤3)所设计的引物，添加模板、纳米金胶液、蛋白质、缓冲液及各种所需的酶，混合均匀后进行实时等温扩增，得到高准确度单核苷酸多态性位点信息。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：赵永席，陈锋，赵越，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61