一种花生种质资源果腐病抗性鉴定的方法技术

本发明专利技术涉及一种花生种质资源果腐病抗性鉴定的方法，属于花生抗病性鉴定方法技术领域。该方法以花生果腐病病原菌Calonectria sp.为接入菌，在花生的苗期、盛花期、浆果期采用掩埋喷灌方法接入。花生种植前土壤需均质化，并按随机种植模式种植。为保证接入等量菌种，首先进行病原菌快速、大批的半定量培养，而后在各接种时期按等量接种方法接入。收获时对各品种烂果率进行统计。该方法能够同时对多个花生种质资源进行果腐病抗性的鉴定、比较，结果准确可靠，重复性好。对抗果腐病花生品种的培育及抗病机制的研究具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种花生种质资源果腐病抗性鉴定的方法，属于花生抗病性鉴定方法

技术介绍
花生果腐病，俗称烂果病，是世界范围内普遍发生的花生土传病害之一, 危害严重, 难于治理, 一般发病田产量损失达15%左右, 重病田可致绝收。花生抗病品种的筛选与培育是从根本上实现果腐病防控的有效途径。但由于花生果腐病病原菌培养物土壤扩繁困难，回接难度大，尤其是不产孢的菌丝体病原菌定量回接难度极大，使得花生种质资源果腐病抗性的鉴定、比较成为制约抗病品种培育的瓶颈。病原菌Calonectria sp.（保藏号：CGMCC No. 9807）是本实验室分离纯化的一株广普性的、高致病性的花生果腐病病原菌，该菌对温度敏感、目前实验技术条件下不产孢。以此菌为接入对象，建立一种花生种质资源果腐病抗性鉴定的新方法，对将来花生果腐病病原菌的回接与抗性品种选育具有普遍指导意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种花生种质资源果腐病抗性鉴定的方法，以克服现有条件下病原菌菌丝体回接困难、难以量化等技术瓶颈。该方法以花生果腐病病原菌Calonectria sp.为接入菌，在花生的苗期、盛花期、浆果期采用掩埋喷灌方法接入。花生种植前土壤需均质化，并按随机种植模式种植。为保证接入等量菌种，首先进行病原菌快速、大批的半定量培养，而后在各接种时期按等量接种方法接入。该方法能够同时对多个花生种质资源进行果腐病抗性的鉴定、比较，结果准确可靠，重复性好。本专利技术还进一步提供了上述花生种质资源果腐病抗性鉴定方法的优选技术方案：作为优选，所述的病原菌为Calonectria sp. 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014.10.20，保藏号为CGMCC No. 9807。该菌是从花生果腐病病果中分离纯化获得，其ITS序列与Calonectria morganii相似度为99%。作为优选，所述的土壤均质化是指：田间种植土壤需深耕、翻匀、耙细、整平；而盆栽土壤需堆积后翻匀、等量分装；使供试土壤尽可能保证均质化。作为优选，所述的随机种植模式是指田间种植需划分小区，每个小区1.32 m2，每个品种设置三个重复处理，小区位置随机划分。采用双粒播种，穴距15cm，大小行距80cm、30cm，垄长1.65m。盆栽试验也是每个品种设置三个重复，一个重复5棵。各处理种植、管理模式一致。作为优选，所述的病原菌快速、大批的半定量培养是指首先将冻存菌在改良察氏培养基平板上活化，活化后采用打孔法将两个5mm的菌斑接入50ml改良察氏液体培养基中，28℃、 200rpm震荡16h进行富集培养；取1.5ml上述的富集培养液，涂布于12cm直径的改良察氏培养基平板上（培养基厚度0.5cm），存留于超净工作台晾干后，按上述方法重复涂布两次，待晾干后至于培养箱28℃暗培养。3-4天后待菌丝体布满整个平板，取出接种。作为优选，所述的按等量接种方法接入是指在每个接种时期，菌丝体如权利要求5所述培养后，将每个平板的培养物（与培养基一起）等量分成八份，于每穴花生的主根5-10cm深处接入一份培养物，以达到等量接入且土壤扩繁的目的。作为优选，所述的掩埋喷灌方法是指如权利要求6所述接入等量培养物后，掩埋盖土，之后于垄上两行花生之间开沟10-15cm深，采用喷灌方式浇水，一个小区需水6L，保证水量尽可能均匀。如此，满足菌丝体的土壤扩繁需求。具体实施方式下面通过具体实施例进一步说明本专利技术的技术方案，本专利技术包括但不限于以下实施方式。根据现有技术对本专利技术所进行的不脱离本专利技术实质内容的改变，仍属于本专利技术的保护范围。实施例1：选定17个花生品种作为参试品种，于青岛莱西花生试验基地专门的隔离地块进行田间回接试验。种植前，将该地块深耕、翻匀、耙细、整平，划分为接种和不接种两个地块，中间设立隔离带。两地块分别划定51个小区，每个小区1.32 m2，每个品种设置三个重复处理，小区位置随机划分。采用双粒播种，穴距15cm，大小行距80cm、30cm，垄长1.65m。于2014年4月28日播种。接入病原菌Calonectria sp.。回接前，首先将冻存菌在改良察氏培养基平板上活化，活化后采用打孔法将两个5mm的菌斑接入50ml改良察氏液体培养基中，28℃， 200rpm震荡16h进行富集培养；取1.5ml上述的富集培养液，涂布于12cm直径的改良察氏培养基平板上（培养基厚度0.5cm），存留于超净工作台晾干后，按上述方法重复涂布两次，待晾干后至于培养箱28℃暗培养。3-4天后待菌丝体布满整个平板，取出接种。接种时期分别选在花生的苗期、盛花期和浆果期，由于该菌为高温不耐受菌，室内试验表明超过32℃该菌即生长缓慢，难以扩繁，因此后期不再接菌。接菌时按等量接种方法接入——将每个平板的培养物（与培养基一起）等量分成八份，于每穴花生的主根5-10cm深处接入一份培养物，掩埋盖土之后于垄上两行花生之间开沟10-15cm深，采用喷灌方式浇水，每个小区浇水6L, 尽可能保证水量均匀，非接菌地块同期等量进行喷灌。如此达到等量接入病原菌且土壤扩繁的目的，且接菌地块与非接菌地块管理模式一致，具有可比性。收获后对各处理的烂果数进行考种统计。结果表明接种地块所有品种的烂果率均不同程度高于非接种地块，证明了回接实验的可靠性。将这17个花生品种的烂果率进行比较，筛选出两个高抗果腐病品种——花育20号和花育29号，一个中抗品种——花育24号，三个感病品种——花育35号、花育38号和花育43号。实施例2：将上述田间试验涉及的17个花生品种同步在青岛的山东省花生研究所进行盆栽试验，以验证该方法的稳定性与可靠性。种植前将土壤堆积后翻匀、等量分装，采用45cm口径的瓦盆种植。采用双粒播种方式，每个品种设置接种与非接种两个处理，每个处理三个重复，一个重复5棵。各处理种植、管理模式一致。于2014年5月5日播种。同样以上述花生果腐病病原菌Calonectria sp.为接入菌，繁种方式与田间试验一致。接种时期同样选择在花生的苗期、盛花期和浆果期（较田间试验接种日期错后一个周）。接菌时按等量接种方法接入——将每个平板的培养物(与培养基一起)等量分成八份，于每盆花生的主根5-10cm深处接入一份培养物，掩埋盖土之后，浇150ml水。非接菌的处理同样每盆浇150ml水。如此达到等量接入病原菌且土壤扩繁的目的，且保证了接菌处理与非接菌处理管理模式一致。收获后对各处理的烂果数进行考种统计。结果表明接种处理所有品种的烂果率均不同程度高于非接种处理，进一步证明了该回接实验的可靠性。将这17个花生品种的烂果率进行比较，与田间试验结果趋势一致，筛选出两个高抗果腐病品种 ——花育20号和花育29号，一个中抗品种——花育24号，三个感病品种——花育35号、花育38号和花育43号。该专利技术专利保藏信息如下：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏编号：CGMCC No.9807分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种花生种质资源果腐病抗性鉴定的方法，其特征在于：该方法以花生果腐病病原菌Calonectria sp.为接入菌，在花生的苗期、盛花期、浆果期采用掩埋喷灌方法接入；花生种植前土壤需均质化，并按随机种植模式种植；为保证接入等量菌种，首先进行病原菌快速、大批的半定量培养，而后在各接种时期按等量接种方法接入；收获时对各品种烂果率进行统计。

【技术特征摘要】
1.一种花生种质资源果腐病抗性鉴定的方法，其特征在于：该方法以花生果腐病病原菌Calonectria sp.为接入菌，在花生的苗期、盛花期、浆果期采用掩埋喷灌方法接入；花生种植前土壤需均质化，并按随机种植模式种植；为保证接入等量菌种，首先进行病原菌快速、大批的半定量培养，而后在各接种时期按等量接种方法接入；收获时对各品种烂果率进行统计。
2.一种花生种质资源果腐病抗性鉴定的方法，其特征在于：所述的病原菌为Calonectria sp. 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014.10.20，保藏号为CGMCC No. 9807；该菌是从花生果腐病病果中分离纯化获得，其ITS序列与Calonectria morganii相似度为99%。
3.一种花生种质资源果腐病抗性鉴定的方法，其特征在于：所述的土壤均质化是指：田间种植土壤需深耕、翻匀、耙细、整平；而盆栽土壤需堆积后翻匀、等量分装；使供试土壤尽可能保证均质化。
4.一种花生种质资源果腐病抗性鉴定的方法，其特征在于：所述的随机种植模式是指田间种植需划分小区，每个小区1.32 m2，每个品种设置三个重复处理，小区位置随机划分；采用双粒播种，穴距15cm，大小行距80cm、30cm，垄长...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈明娜，禹山林，陈娜，潘丽娟，迟晓元，王冕，王通，杨珍，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37